אשכולית חוזרת לתפריט: פיתוח אשכולית בטוחה לצריכת כלל האוכלוסייה

ליבנת גולדנברג, פליקס שייע, מירה וייסברג, לנה פלסר, גילאור קלי, יוסי יניב, אורי מסוק, טל ארד, עמיר שרמן, רון אופיר, יורם אייל וניר כרמי

המחלקה להשבחת עצי פרי, מכון וולקני

רקע

האשכולית ידועה כפרי הדר בריאותי ביותר, אך עלולה להיות מסוכנת לצריכה עבור אנשים הנוטלים תרופות הנמצאות בשימוש נרחב, כגון סטטינים להורדת כולסטרול, תרופות להורדת לחץ דם, נוגדי דכאון שונים ועוד. לשם המחשה, בארה"ב נוטלי הסטטינים בלבד מהווים כ- 35% מהאוכלוסייה הכללית. לרוב, הסכנה היא שחומרים המצויים באופן טבעי במיץ האשכולית (פורנוקומרינים) עשויים לעכב את פירוקן של התרופות וכך לגרום למנת יתר של התרופה בדם. חומרים אלו קיימים בכל פירות ההדר, למעט מנדרינות ותפוזים, אך הגנים האחראים ליצירת החומרים הללו בהדרים לא היו ידועים עד עתה. במחקר זה, איתרנו את הגן האחראי על יצירת פורנוקומרינים בהדרים, וגילינו שגן זה תקול במנדרינות ובתפוזים, וזו הסיבה לכך שאין מניעה לצרוך תרופות עם פירות אלו. בהמשך למחקר זה, המטרה הבאה שלנו היא לפגוע בגן הקיים באשכולית וכך לפתח אשכולית ללא פורנוקומרינים, שאינה טרנסגנית ובטוחה לצריכה, אשר תביא בשורה לאוכלוסייה הולכת וגדלה של צורכי תרופות ברחבי העולם.

מהלך המחקר

לצורך מחקר זה יצרנו שתי אוכלוסיות: (א) מנדרינה 'פזית' X פומלו 'צ'נדלר', (ב) מנדרינה 'אורה' X אשכולית 'הדסון' (איור 1). מאחר והוכחנו בניסויים קודמים כי רמת הפורנוקומרינים בעלים מעידה על רמתם בפרי, יכולנו לסרוק את הצאצאים לתכולת פורנוקומרינים כבר בשלב הצמח הצעיר. בנוסף לניתוח רמת הפורנוקומרינים בהורים ובצאצאים, ביצענו אנליזה של מבנה וביטוי גנים בהורים, ולאחר איתור הגן המועמד אימתנו את הפעילות של האנזים המקודד על ידי גן זה בעזרת ביטוי בעלי טבק ובדיקת התוצרים.

תוצאות

באוכלוסיית 'פזית'X'צ'נדלר' כל הצאצאים שבדקנו ייצרו פורנוקומרינים ללא יוצא מן הכלל, ולכן לא המשכנו במחקר עם אוכלוסייה זו (איור 1). לעומת זאת, באוכלוסיית 'אורה'X'הדסון' ראינו התפלגות מדהימה בייצור הפורנוקומרינים, כך שמחצית מהצאצאים ייצרו פורנוקומרינים ואילו החצי השני לא ייצר כלל. התפצלות זו מעידה על כך שתכונה זו כנראה מבוקרת על ידי גן אחד בלבד. כך, מנדרינה 'אורה' תמיד תתרום אלל פגום לגן, ואילו אשכולית 'הדסון' תתרום למחצית מהצאצאים אלל פגום ולמחצית השנייה אלל תקין (איור 1).

לשם איתור הגן האחראי על יצירת פורנוקומרינים בהדרים, השווינו את ביטוי הגנים בעלים צעירים של אשכולית 'הדסון' למנדרינה 'אורה'. ממחקרים שפורסמו בצמחים אחרים, שיערנו כי הגן שאותו אנו מחפשים שייך למשפחת ה-2OGD, ומסריקה של כ-170 גנים המשתייכים למשפחה זו עלה גן אחד בלבד שהתבטא ברמות גבוהות ב'הדסון' ולא התבטא כלל ב'אורה' ('גן 710'). בדיקה של מבנה הגן בגנום המנדרינה לעומת הפומלו (לא פורסם גנום אשכולית נכון להיום) הראתה כי בגנום המנדרינה קיים מחדר באורך 655 בסיסים שמשבש את האזור המקודד לאנזים, לעומת גן תקין לחלוטין בגנום הפומלו (איור 2). כשבדקנו את שאר מיני ההדרים, ראינו כי קיים גן תקין בחושחש, אתרוג ולימון ואילו בתפוז מצוי מחדר זהה לקיים במנדרינה. לאחר מכן, בדקנו את התפצלות הגן בצאצאים של אוכלוסיית 'אורה'X'הדסון', וראינו כי ישנה התאמה מלאה בין נוכחות גן תקין (ללא מחדר) לבין יצירת פורנוקומרינים. בכדי לאמת זאת, חזרנו לצאצאים של אוכלוסיית 'פזית'X'צ'נדלר' ואכן לכולם היה גן תקין, בהתאמה לייצור המשמעותי של פורנוקומרינים.

בכדי לאשר כי הגן המועמד אכן מעורב ביצירת פורנוקומרינים, ביטאנו את 'גן 710' מפומלו בעלי טבק ובחנו את פעילות האנזים המקודד בנוכחות סובסטרט מתאים. שני התוצרים שהתקבלו מניסוי זה (סקופולטין ואומבליפרון, החומר הראשון שנוצר במסלול יצירת הפורנוקומרינים; איור 3) מעידים על פעילות האנזים המקודד כאנזים המפתח במיני הדרים שמייצרים פורנוקומרינים.

מחקר מעמיק יותר של האזור הגנומי בסביבת הגן הראה כי למעשה מדובר בצבר של חמישה גנים, כולם ממשפחת ה-2OGD, והמצויים בסמיכות אחד לשני (איור 4). כאשר שלושת הגנים האמצעיים כמעט זהים אחד לשני ושני הגנים הקיצוניים דומים מעט פחות ל'גן 710'. מבין שלושת הגנים הדומים ביותר, רק גן 710 התבטא באופן משמעותי בעלים צעירים ובחנטים של 'הדסון' (איור 5), ולכן הוא ככל הנראה הגן העיקרי אשר מעורב ביצירת קומרינים ופורנוקומרינים ברקמת העלה/פרי בהדרים.

בכדי לבדוק האם הגנים הללו מתבטאים ברקמות אחרות, הנבטנו זרעים של 'הדסון' ובדקנו את ביטוי הגנים בשורשים. מאחר והזן 'אורה' הוא חד עוברי והזרעים אינם זהים לאמא, השתמשנו בזן הרב-עוברי 'מורקוט' להפקת שורשים. פרופיל ביטוי הגנים בשורשים הראה כי הגן הסמוך, גן 720, הוא הגן האחראי על יצירת אומבליפרון בשורשים, וכי הוא מתבטא אף בשורשים של מנדרינה (איור 5).+

 שלבי כאן את איור 5.

כשבדקנו לעומק את מבנה הגן 730 מצאנו כי אזור הקישור לסובסטרט שלו משובש, ולכן אנחנו מעריכים שהוא אינו תקין. באשר לגן 670: מסריקה שעשינו במאגרי המידע, עלה כי גן זה מתבטא לאחר הדבקה בפתוגנים שונים, ביניהם גם הפטרייה פניציליום דיגיטטום. לאור ממצא זה, החלטנו לבדוק את פעילות תוצר הגן 670 בעלי טבק, וראינו כי לאנזים המקודד יש רק תוצר אחד – סקופולטין, ולא אומבליפרון (איור 6). לכן, בפירות מנדרינה או תפוז לא צפויים להווצר פורנוקומרינים אף במקרה של הדבקה על ידי פתוגן.

מסקנות

במחקר זה זיהינו את גן המפתח המעורב ביצירת פורנוקומרינים בפרי הדר, והראינו כי הוא תקין בפומלו, אשכולית והדרים נוספים, אך תקול במנדרינה ותפוז מתוק. בנוסף, גן זה הוא חלק מ"צבר" (cluster) של 5 גנים בעלי זהות גבוהה, אשר ביניהם איתרנו גן המעורב ביצירת קומרינים בשורשים (גן 720) וגן נוסף אשר ככל הנראה מעורב בהגנה מושרית של הצמח מפני פתוגנים (גן 670).

עבודה זו מהווה את הבסיס לסלקציה של זני הדרים חדשים אשר אינם מייצרים פורנוקומרינים, ולעריכה גנומית של גן 710, אשר תאפשר יצירת אשכולית בטוחה לצריכה על ידי אוכלוסייה הולכת וגדלה של צורכי תרופות ברחבי העולם.  

Goldenberg, L., Ghuge, S.A., Doron-Faigenboim, A., Carmeli-Weissberg, M., Shaya, F., Rozen, A., Dahan, Y., Plesser, E., Kelly, G., Yaniv, Y., Arad, T., Ophir, R., Sherman, A., Carmi, N. and Eyal, Y. (2025), A 2OGD multi-gene cluster encompasses functional and tissue specificity that direct furanocoumarin and pyranocoumarin biosynthesis in citrus. New Phytol, 245: 1547-1562. https://doi.org/10.1111/nph.20322