בחינת יעילות חיטויי קרקע מבוססי pH בסיסי ובשילוב חומרים פעילים לצמצום ההידבקות של צמחי עגבניות בטובמווירוס ToBRFV המשתמר בקרקעות גידול

אורי מולד^1,2, אלישבע סמיט¹, נטע לוריא¹, ילנה בקלמן¹, עודד לכמן¹, מיטל רכס² ואביב דומברובסקי¹

¹ המחלקה למחלות צמחים וחקר עשבים, מנהל המחקר החקלאי, מכון וולקני

² המכון לכימיה, הפקולטה למתמטיקה ולמדעי הטבע, גבעת רם, האוניברסיטה העברית בירושלים

מבוא

מגפות עולמיות מהוות איום ממשי לגידולים חקלאיים בעלי חשיבות כלכלית למזון, טקסטיל ומספוא, בעולם בכלל ובישראל בפרט. כמעט חצי (47%) מהפתוגנים המובילים למגפות עולמיות בחקלאות העולמית הינם נגיפים¹. בעשור האחרון, נגיף הקמטים החומים של פרי העגבנייה  Tomato brown rugose fruit virus (ToBRFV) השייך לסוג של הטובמווירוסים (Tobamovirus) פוגע משמעותית בכמות ואיכות היבול בגידול עגבניות מסחרי בארץ ובמדינות רבות בעולם (איור מספר 1). נגיפים המשתייכים לסוג של הטובמווירוסים מועברים ביעילות במגוון דרכים וצורות של הדבקה מכאנית (מגע ידיים של העובדים, כלים חקלאים כגון מזמרות וסכינים המשמשים לביצוע פעולות אגרוטכניות ועוד) ללא כל תלות בווקטור חרקי. המחלה הנגרמת לצמח המאכסן הינה סיסטמית כך שהנגיף נוכח ומשתכפל בכל רקמות הצמח.

מאז הופעת ToBRFV בשנת 2014 בישראל ובשנת 2015 בירדן הנגיף התפשט אל למעלה מ-60 מדינות ברחבי המזרח התיכון ואירופה, צפון אפריקה, ארה"ב ומרכז אמריקה, דרום אמריקה ולמדינות שונות באסיה ^2–4. במשך שלושה עשורים זני עגבנייה הנושאים את האללים Tm-2 ו- Tm-2² סיפקו הגנה רחבה כנגד נגיפי טובמו כדוגמת Tobacco mosaic virus (TMV) ו- Tomato mosaic virus (ToMV) בגידולי עגבנייה מסחריים, עד הופעתו של ToBRFV שהראה יכולת להתגבר על העמידויות הקיימות ובפועל מדביק באופן סיסטמי את צמחי עגבנייה ^5,6. בדומה לנגיפי טובמו אחרים, ל- ToBRFV יכולת שרידות/השתמרות גבוהה בגזם/פסולת צמחית נגועה, בקרקע, ע"ג משטחים בטון, חוטי הדליה, בגדי עבודה, כלים חקלאיים (מרסס, מזמרות וסכינים). כמו כן, ToBRFV משתמר בכל רקמות הצמח הנגוע, עלים גבעולים שורשים ופירות ואף ברקמות חיצוניות של זרעים (קליפת הזרע) שהופקו מפירות נגועים. תכונות אלו תורמות להגברת יכולת ההפצה של הנגיף בין חממות שונות, מגדלים שונים ומעבר בין מדינות שונות בעולם ^7,8. בתום מחזור הגידול של צמחים נגועים, נגיפי טובמו יכולים להשתמר בקרקע בתוך חלקי הצמח הנגוע (שורשים וגבעולים) כך שכל פסולת צמחית נגועה עשויה להשתמר במשך חודשים ולהוות מקור מדבק ראשוני ⁹. בהמשך יתרחש אירוע ההדבקה של שתילים מהקרקע: בעת ביצוע שתילה של צמחים במחזור גידול עוקב, בשלב הראשון מתבצעת שליפה של השתילים ממגש השתילה, פעולה המובילה לקריעה או פציעה (לעיתים מיקרוסקופית) של השורשים. בהמשך לפציעת השורשים, פעולת ההידוק של השתיל בקרקע מאפשרת מגע בין הנגיף המצוי/משתמר בקרקע (ממחזור גידול קודם) לפצע הקיים ברקמות השורש וכתוצאה מכך מתאפשרת ההדבקה בנגיף. לאחר כשבועיים הצמחים שנדבקו מהנגיף בקרקע הופכים לנגועים סיסטמית (נוכחות הנגיף בכל רקמות הצמח), וצמחים אלו מהווים מקור מדבק להפצה שניונית של הנגיף אל עבר צמחים שכנים או אחרים הגדלים בסמוך בעיקר במהלך ביצוע פעולות אגרוטכניות לעיצוב הצמח (זירוד והדליה), אך גם בעת ביצוע פעולות תחזוקה כגון ריסוסים או קטיפים. ההשתמרות של החלקיק הנגיפי (ויריון) של נגיפי טובמו בקרקע נעוצה בין היתר ביציבות פיזיקלית הגבוהה שלהם, ובנוסף בעובדה ששברי/חלקי פסולת צמחית נגועה, בעיקר חלקי שורשים, עשויה להישאר בעומק הקרקע גם לאחר סילוק מרבית הפסולת הצמחית (גזם) שנמצאת מעל פני הקרקע. השתמרות נגיפי טובמו בקרקעות גידול מהווה אתגר לגידולי עגבנייה וירקות נוספים ודורשת יישום של שיטות התמודדות שונות. שיטות אלו עשויות להוות חלק ממשק התמודדות עם מחלות ויראליות המשתמרות בקרקע והוא צריך להוות פתרון ביניים עד שיוצגו בשוק זני עגבניות עמידים לוירוס.

מטרות המחקר:

1. בחינת יכולת ההשתמרות של ToBRFV בקרקעות יבשות ורטובות שנאספו לאחר מחזורי גידול צמחי עגבנייה מודבקים. במקביל התבצעו ניסויים להבנת יציבות החלקיק וחומצת הגרעין הנגיפיים כתלות ב-pH ע"י שימוש באמצעים מולקולריים וע"י שימוש בצמחי בוחן במבחנים ביולוגיים.

2. בהתבסס על תוצאות ומסקנות החלק הראשון ששימשו ליצירת פרוטוקול שטיפת קרקעות מזוהמות בוירוס. יישום הפרוטוקול הוביל להפחתה מובהקת בהדבקה מהקרקע ב-ToBRFV של צמחי עגבנייה לעומת קרקעות לא מטופלות.

שיטות וחומרים

הפקת תכשיר נגיפי מנוקה מקרקע מזוהמת בוירוס: צמחי עגבניות מהזן איקרם הודבקו מכאנית ב- ToBRFV לאחר 10 ימים מהשתילה והצמחים הנגועים סיסטמית בוירוס גודלו בבית רשת. לאחר 6 חודשי גידול נעקרו הצמחים והקרקע הנגועה נאספה ועורבבה לערמה. דגימת קרקע מהערמה שימשה להכנת תכשיר נגיפי מנוקה ששימש לביצוע דיאגנוסטיקה מולקולרית לזיהוי הנגיף בדוגמאות הקרקע (זמן 0). הכנת התכשיר התבצעה ע"י ערבוב דוגמת קרקע במים, סינון דרך בד עם נקבוביות בגודל 22-25 מיקרומטר וריכוז בצנטריפוגה במהירות נמוכה (9,700 x g) למשך 20 דקות. לאחר מכן הנוזל העליון (מכיל את הנגיפים) הופרד והוכנס לאולטרה-צטנריפוגה במהירות גבוהה ביותר (200,000 x g) למשך 3 שעות להשקעת הנגיפים. המשקע שהתקבל ומכיל את הנגיפים הורחף בבופר פוספאט בריכוז 0.01 M. בהמשך בוצע שלב של ניקוי נגיפים דרך "כרית סוכרוז" של 20% סוכרוז והשקעה נוספת באולטרה-צנטריפוגה. לבסוף, המשקע הנגיפי שהתקבל הורחף בבופר פוספאט לקבלת תכשיר נגיפי מנוקה בריכוז גבוה.

בחינת נוכחות ToBRFV בתכשיר הנגיפי שהופק מהקרקע הנגועה בוצעה בשיטות מולקולריות, סרולוגיות מורפולוגיות וביולוגיות: שיטות מולקולריות-להגברת הגנום המלא הנגיפי של ToBRFV בריאקציה של RT-PCR. שיטות סרולוגיות-לזיהוי של חלבון המעטפת הנגיפי בעזרת נוגדנים ספציפיים בשיטת Western blot. שיטות מורפולוגיות- לויזואליזציה של חלקיקי הנגיף (טובמווירוס) במיקרוסקופ אלקטרונים חודר (TEM).  מבחן ביולוגי-בהדבקה של צמחי עגבנייה וטבק.  

בחינת יכולת ההשתמרות של ToBRFV בקרקעות נגועות: ערמת הקרקע הנגועה ב-ToBRFV חולקה לשתי ערמות נפרדות: 1- ערמה רטובה שהושארה במשטר המטרה יומי לנביטת עשביה; 2- ערמה יבשה שחולקה לשתי תת-ערמות נוספות – אחת שימשה לבחינת השתמרות הנגיף בטווח זמן קצר ואילו הערמה השנייה שימשה לבחינת השתמרות הנגיף לתקופת זמן ארוכה יותר. על מנת לבחון את יכולת ההדבקה מהקרקע כתלות בגיל הערמה (קרי – הזמן שעבר מאז עקירת הצמחים המודבקים ואיסוף הקרקע) התבצעו דגימות קרקע תקופתיות לשימוש כמצע גידול צמחי עגבנייה בעציצים. בכל אחד מעיתויי הדגימה (ערמה יבשה וערמה רטובה בנפרד) הקרקע שימשה כמצע לשתילת 50 שתילי עגבנייה אשר עברו קטימת שורשים לפני השתילה (להגברת רגישותם להדבקה בנגיף). בכל אחת מהחזרות בניסוי, לאחר כ-40 יום מהשתילה נאספו דוגמאות עלים מהצמחים לבדיקת נוכחות ToBRFV בשיטת ELISA (שיטה זו מאפשרת זיהוי ספציפי של חלבון המעטפת הנגיפי). תוצאה חיובית בבדיקת ELISA מלמדת כי הצמחים נדבקו ב- ToBRFV מהמדבק הנגיפי שבקרקע.

בחינת שלמות החלקיק הנגיפי של ToBRFV בתנאי  pHשונים: במטרה ללמוד את ההשפעה של pH על שלמות החלקיק הנגיפי של ToBRFV נעשה שימוש בתכשיר הנגיף המנוקה שחולק ל-12 מבחנות של בבופר פוספאט בערכי pH שונים בין 1.0 ל-12.0. לאחר כשעה של הדגרה בטמפרטורת החדר התמיסות המכילות את הנגיף ב- pH השונים התמיסות הוכנו לויזואליזציה ונבחנו במיקרוסקופ אלקטרונים חודר (TEM) מסוג Tecnai G2 Spirit Twin.

בחינת השפעת pH על יכולת ההדבקה של ToBRFV: במטרה ללמוד את ההשפעה של pH על כושר ההדבקה והיציבות של ToBRFV נעשה שימוש בתכשיר הנגיף המנוקה שחולק ל-12 מבחנות של בבופר פוספאט בערכי pH שונים בין 1.0 ל-12.0. לאחר כשעה של הדגרה בטמפרטורת החדר התמיסות המכילות את הנגיף ב- pH השונים שימשו לאילוח של צמחי טבק מסוג גלוטינוזה Nicotiana glutinosa המגיבים להדבקה בטובמווירוס ToBRFV בתגובת Hypersensitive response (HR)  ע"י יצירת נקפים נקרוטיים (local lesions). מספר הנקפים הממוצע לעלה שימש כמדד כמותי לפוטנציאל ההדבקה של ToBRFV כתלות בערך ה-pH של התמיסה.

בחינה ראשונית של יישום טיפולי קרקע מבוססי pH להפחתת המדבק הנגיפי בקרקע: ערמת קרקע שנאספה לאחר גידול מחזור עגבנייה מלא ומודבק ב-ToBRFV חולקה ל-5 טיפולים שבוצעו בדליים בנפח של 10 ליטר בהם התבצע היישום של הטיפולים השונים: טיפולי מס' 1 שימש כביקורת ללא טיפול. טיפול מס' 2 שטיפה עם מי ברז בוצע ב- 3 נפחים (pH = 8.35) לבחינת ההשפעה של דחיקה פיזית של המדבק מהקרקע ללא קשר לטיפולי ה-pH. טיפול מס' 3 נשטף עם תמיסת סטרוכלור (3% Cl-TSP)  Chlorinated-Tri Sodium Phosphate 3%   (pH=11.6)של חברת סטרוקם. טיפול מס' 4 נשטף עם תמיסה של Cl-TSP  3% בתוספת של KOH  1% (אשלגן הידרוקסידי) pH=12.7)). דלי מס' 5 נשטף עם תמיסת סודה קאוסטית (נתרן הידרוקסידי/NaOH) ((pH =13.0. כל טיפול נעשה עם תמיסות בנפח 5 ליטר שנמזגו באופן שאפשר חלחול מלא לאורך זמן ללא הצפה. לאחר 24 שעות הדליים המטופלים (מס' 2-5) עברו שטיפה נוספת עם מי השקיה לניקוי החומרים הפעילים ומניעת נזקים אפשריים למבנה הקרקע. לבסוף האדמה בכל דלי חולקה לעציצים בהם נשתלו 50 צמחוני עגבנייה שעברו קיטום שורשים. 40 יום לאחר שתילה הצמחים נדגמו לבדיקת נוכחות ToBRFV בשיטת ELISA להבנת ההשפעה על הדבקה מהקרקע. הניסוי בוצע ב-3 חזרות.

תוצאות

זיהוי מולקולרי של ToBRFV בקרקעות נגועות: תכשיר נגיפי מנוקה שהופק מקרקעות נגועות ב-ToBRFV נבדק לנוכחות ToBRFV. 1. התקבל זיהוי סרולוגי של חלבון המעטפת הנגיפי במשקל של 17.5 קילו-דלטון בשיטת Western blot. 2. התקבלה הגברה של גנום נגיפי מלא של ToBRFV באורך של 6,400 זוגות בסיסים בריאקציית RT-PCR. 3.  זיהוי מורפולוגי במיקרוסקופ אלקטרונים (TEM) של ויריונים במבנה של מקלון קשיח בעובי של 18 ננומטר ובאורך משתנה של 250-600 ננומטר  האופייניים לטובמווירוס ToBRFV.

בחינת יכולת ההשתמרות של ToBRFV בקרקעות נגועות: תוצאות ניסויי ההדבקה הראו כי יכולת ההדבקה של האדמה מהערימה היבשה מגיעה לשיא של 23% הדבקה 17 ימים מאיסוף האדמה וכי יכולת ההדבקה נשמרת עד 80 ימים מהאיסוף (תרשים מס' 1). לעומת זאת, יכולת ההדבקה של הערימה הרטובה הייתה גבוהה בהרבה והגיעה לשני שיאים של 50% ו-48%, 72 ו-98 ימים לאחר איסוף, בהתאמה. יתר על כן, הדבקה סיסטמית גבוהה (33%) נשמרה עד 129 ימים לאחר איסוף. רק לאחר 200 ימים, יותר מחצי שנה לאחר הפרדת הצמחים מהקרקע, לא התקבלה הדבקה מאדמת הערימה הרטובה.

בחינת שלמות החלקיק הנגיפי ההדבקה של ToBRFV כתלות ב-pH: בחינת תמיסות הנגיף המנוקה בערכי ה-pH השונים התבצעה במיקרוסקופ אלקטרונים חודר. חלקיקים שלמים אופיינים לנגיפי טובמו נצפו בטווח pH של 1.0-10.0, כאשר ב- pH 11.0 נצפו שברי חלקיקים בלבד וב- pH 12.0 לא נצפו מבנים כלל.

בחינת יכולת ההדבקה של ToBRFV כתלות ב-pH: תמיסות תכשיר נגיפי מנוקה של ToBRFV בערכי pH של 1.0-12.0 יושמו על צמחי טבק מסוג גלוטינוזה. לאחר 3 ימים התבצעה ספירה של נקפים מקומיים על הכלים. הדבקת צמחי גלוטינוזה עם תמיסות תכשיר נגיפי מנוקה התאפשרה בטווח pH 1.0-10.0, אמנם עם מספר נקפים נמוך באופן משמעותי ב-pH של 1.0. הדבקה בערכי pH של מעל 11.0-12.0 לא התאפשרה כלל.

איור מס' 3. זיהוי חלקיקי ToBRFV בתכשיר נגיפי מנוקה בטווח pH 1.0-12.0 במיקרוסקופ אלקטרונים חודר (TEM).

טיפולי קרקע לצמצום המדבק הנגיפי והפחתת ההידבקות של צמחי עגבנייה ב-ToBRFV

מהתוצאות שהתקבלו נמצא כי שני הטיפולים המבוססים על  Cl-TSP 3% עם ערכי pH מעל 11.0, הובילו להפחתה משמעותית של אחוזי ההדבקה לעומת קבוצת הביקורת – טיפול מס' 3 עם 6.3 ± 39.7% וטיפול מס' 4 עם 5 ± 5%, תוצאות שהיו עם שוני מובהק סטטיסטית מההדבקה באדמת הביקורת הלא מטופלת – 39.7%±9.0. טיפול מס' 2 שנשטף אך ורק עם מי השקיה לא הראה הפחתת הדבקה עם מובהקות סטטיסטית בהשוואה לדלי שלא עבר טיפול, ובנוסף הייתה שונות גבוהה בין החזרות – 19.1%±17.7. טיפול מס' 5 שנשטף עם סודה קאוסטית הוביל למניעת הדבקה מוחלטת, אך בו זמנית הטיפול גרם לפגיעה במבנה הקרקע שהפכה לבוצית, ולפגיעה ביכולת ניקוז הנוזלים ובנקבוביות ולתמותה גבוהה של כמעט מחצית (48.9%) מהצמחים.

סיכום עיקרי הממצאים

• הבנת משך זמן ההשתמרות של הטובמווירוס ToBRFV בקרקעות ולימוד צורת ההדבקה של השתילות הצעירות מהקרקע הנגועה ממחזור הגידול הקודם.
• תוצאות ניסויים לבחינת הרגישות של הנגיף לתנאי pH שונים סיפקו מידע חיוני אותה ניתן יהיה ליישם בעתיד בטיפולי קרקע להפחתת המדבק הנגיפי.
• הוכח כי ל-ToBRFV רגישות לערכי pH בסיסיים מעל 10.0, הן מבחינת שלמות החלקיק הנגיפי והן מבחינת יכולת ההדבקה. כמו כן, הוכח כי לערכי pH חומציים אין השפעה על שלמות הנגיף או יכולת ההדבקה.
• טיפול קרקע עם חומרים בעלי pH גבוה מ-10 כדוגמת Cl-TSP בשילוב שטיפות של הקרקע  הראו יכולת בצמצום המדבק הנגיפי בקרקע ולהפחתת ההדבקה של השתילים בנגיף. עדיף להימנע מטיפולים ב- pH גבוה מ-12.5 על מנת לא לפגוע במרקם הקרקע.

יש לציין ולהדגיש כי הניסויים לחיטוי הקרקע בוצעו בהיקף מחקרי מצומצם, לכן ישנה חשיבות רבה להמשיך וללמוד את צורת היישום האופטימלית בתצפיות שדה נוספות לפני מתן המלצות למגדלים.

ביבליוגרפיה

1.         Jones, R. A. C. Global Plant Virus Disease Pandemics and Epidemics. Plants 10, (2021).

2.         EPPO. Global Distribution of ToBRFV. https://gd.eppo.int/taxon/TOBRFV/distribution

3.         Luria, N. et al. A new israeli Tobamovirus isolate infects tomato plants harboring Tm-22 resistance genes. PLoS ONE 12, 1–19 (2017).

4.         Salem, N., Mansour, A., Ciuffo, M., Falk, B. W. & Turina, M. A new tobamovirus infecting tomato crops in Jordan. Archives of Virology 161, 503–506 (2016).

5.         Pelham, J. Resistance in Tomato To Tobacco Mosaic Virus. Euphytica 15, 258–267 (1966).

6.         Lanfermeijer, F. C. et al. The durable resistance gene Tm-22 from tomato confers resistance against ToMV in tobacco and preserves its viral specificity. Plant Science 167, 687–692 (2004).

7.         Broadbent, L. Epidemiology and Control of Tomato Mosaic Virus. Annual Review of Phytopathology 14, 75–96 (1976).

8.         Dombrovsky, A. & Smith, E. Aspects in Tobamovirus Management in Intensive Agriculture. Intech (2019) doi:http://dx.doi.org/10.5772/57353.

9.         Dombrovsky, A., Mor, N., Gantz, S., Lachman, O. & Smith, E. Disinfection Efficacy of Tobamovirus-Contaminated Soil in Greenhouse-Grown Crops. Horticulturae 8, 563 (2022).