פיתוח ביו-חיישן לניטור רציף ומוקדם של נוכחות עש התפוח המדומה בבתי אריזה (חלק ראשון)

Development of a biosensor for real-time and continuous monitoring of the False Codling Moth presence in mandarins

שותפים למחקר:
ד"ר עדי שדה, חוקרת הגנת הצומח, המכון להדברה ביולוגית של מועצת הצמחים
דר' יבגני ילצוב מכון וולקני, מחלקת איחסון
שחם מגידיש שה"מ, משרד החקלאות
בית אריזה הדרי ניצנים

מבוא

עש התפוח המדומה False Codling Moth (FCM) (Thaumatotibia leucotreta) הוגדר כמזיק הסגר מסוכן בשל היותו פוליפאגי ועלול לפגוע במגוון רחב של פונדקאים בעולם. העש תוקף בין היתר הדרים, רימונים, אבוקדו, אפרסמון, מנגו, פירות גלעיניים, עצי פרי אגוזיים, ענבים, גויאבה, כותנה, תירס, פלפל, קיקיון, אלונים ועוד [1].  בשל כך נוכחות העש מהווה איום חמור על יצוא פירות לשווקים בחו"ל והדרישה לנגיעות הינה אפס. גילויו של פרי נגוע, ולו בזחל אחד, במהלך בדיקה המבוצעת בהגיע הפרי לנמל היעד פוסל את המשלוח באופן מידי, כאשר מדובר באיחוד האירופי ועלול לחסום לאלתר את היצוא של אותה חלקה למשך שנה למדינות הרגישות לנושא, דוגמת ארה"ב, סין וקוריאה [2]. זחלי העש מתפתחים בפרי ועל פי רוב אין סימני היכר או סימנים משניים בולטים לעין ועל כן קשה לזהות פרי נגוע בפרדס ובבית האריזה, לכן ישנו חשש גבוה שפירות נגועים ימצאו דרכם לחו"ל (מ. וייס, השירותים להגנת הצומח, 2010 מתוך שאול בן יהודה 2016) [1]. נכון להיום, אגף הביקורת של השירותים להגנת הצומח ולביקורת ושה"מ מפקחים על הימצאות נגעים בפרדס ובבית האריזה. בשל ההחמרות בדרישות הייבוא לאיחוד האירופאי, יושמה גישה מערכתית לאזור נגוע בעת"מ הכולל ניטור המזיק בפרדס, פיקוח על תהליך המיון, האריזה וייצוא ההדרים – בפרט לייצוא האירופי. לשם הבטחת המשך ייצוא התוצרת, יש לעמוד בדרישות הנהלים של האגף לביקורת. על פי הנהלים החדשים, בית האריזה יהיה אחראי להליך העבודה: מבדק שער הכולל דו"ח או טופס רישום לכל סט שנכנס. כל סט מייצג חלקה פוטנציאלית לייצוא. לשם אישור לייצוא מתבצע תהליך ארוך ומסורבל הדורש התייעלות של זמן ושל דיוק: בדיקת המשטחים לאחר האריזה גורמת לעבודה כפולה בשל הצורך בפירוק ואריזה מחדש של מספר משטחים. רמת הדיוק בזיהוי המזיק בשלביו השונים לא תמיד מספקת ולכן נוהגים לשלוח את המזיק לזיהוי בשירותים להגנת הצומח ולביקורת, דבר שמעכב את התהליך באופן משמעותי. לשם כך, יש צורך בפיתוח שיטה פשוטה, טובה ויעילה לניטור רציף ובזמן אמת של נוכחות עש התפוח המדומה בבית האריזה וללא תלות בממד האנושי.

ביוסנסורים: ביוסנסורים הם אחד מכלי הניטור הקיימים, המשלבים תגובות ספציפיות של מרכיבים ביולוגיים (כגון ,DNA/RNA נוגדנים, אנזימים או תאים) עם שיטות ניטור פיזיקליות (כגון אופטיות, תרמיות, אלקטרוכימיות וכדומה), כאשר התגובה הביולוגית מומרת לסיגנל מדיד באמצעים פיזיקליים. בעשרים השנים האחרונות פותחו ביוסנסורים לתחומים רבים (בריאות, סביבה, חקלאות, מזון ועוד). דוגמאות למערכות מסחריות מוצלחות הן מכשיר למדידת רמות סוכר בדם ובדיקת הריון מהירה. פיתוח כלים חדשים בתחום ההנדסה הגנטית אפשרו יצירת ביוסנסורים מבוססים על מיקרואורגניזמים ככלי לניטור זיהומים שונים במים [3]. ביוסנסורים אלו לא רק מאפשרים זיהוי וניטור מהיר (1-2 שעות) של חומרים מסוכנים, אלא גם נותנים מדד על אופן פגיעתם בתאים (כגון: פגיעות בחומר תורשתי, בחלבונים, בממברנות, נזקים מחומרים מחמצנים וכדומה) [4]. מודיפיקציית מיקרואורגניזמים אפשרו יצירת סיגנל מדיד (כגון: שינוי צבע, הארה או זרם חשמלי) כתגובת חשיפה לחומרים רעילים. תאים אלו יכולים לשמש גם כסנסורים לנוכחות מזהמים באוויר במקומות סגורים [5, 6].

ניטור חומרים נדיפים באוויר: בנוסף לכ-1000 סוגים שונים של חומרים אורגניים נדיפים הנפלטים מצמחים [7] כל סוג חרק פולט חומרים נדיפים יעודיים משלו (פרומונים וכו'). לכן יש פוטנציאל רב לשיטות המאפשרות זיהוי רציף של חומרים אלו באוויר במקומות אחסון או אריזה, לגילוי מוקדם של מזיקים בהם. בשנים הקודמות נעשה שימוש בשיטות של בידוד חומרים – Headspace Solid Phase Microextraction) HS-SPME) ושילובם עם גז כרומטוגרפיה – Chromatography–Mass Spectrometry) GC–MS) לגילוי נוכחות חרקים. במקרים אלו נאספות דוגמאות של אוויר כאשר זיהוי המזיק מתבצע על ידי זיהוי של פרומונים ומטבוליטים [8] או חומרים אורגניים נדיפים המשמשים לקומוניקציה בין פרטי אותו מין של חרקים [9]. שיטות אלו מורכבות, דורשות ציוד יקר ולא ניתן לנטר בזמן אמת. על כן בלתי ניתן ליישום בתנאי שדה.

מטרת הפיתוח היא ליצור מערכת ניידת, פשוטה ומדויקת שתאפשר זיהוי מוקדם של נגיעות בפרי ללא מגע ישיר עם הפירות או תלות בבדיקות ידניות מסורבלות.

במאמר זה בחרנו להציג את שלב פיתוח זנים חדשים של חיידקים ביולומינסנטיים שישמשו לניטור נוכחות עש התפוח המדומה בבתי אריזה

מטרת המחקר הינה פיתוח ביוסנסור חדשני לניטור רציף של חומרים נדיפים הנפלטים מזחלי עש התפוח המדומה בבתי האריזה. הביוסנסור מתבסס על חיידקים ביולומינסנטיים (Bioluminescent) המשמשים כמדווחים ביולוגיים לנוכחות מזיקים.

חלק מרכזי במחקר יתמקד בזיהוי חומרים נדיפים ייחודיים הנפלטים ממנדרינות הנגועות בזחלים לעומת פירות לא נגועים. זיהוי זה יאפשר פיתוח חיידקים מדווחים מותאמים, שיהונדסו גנטית להגיב בצורה סלקטיבית לחומרים אלו בלבד. חיידקים מותאמים יוכלו להבדיל באופן מדויק בין פירות נגועים ולא נגועים, ולספק סיגנל מדיד שיתורגם לאבחנה מדויקת של נגיעות בזחלים.

פיתוח זני חיידקים רגישים לתרכובות נדיפות ספציפיות ממנדרינות נגועות יגביר את דיוק הביוסנסור ויפחית את התלות בבדיקות מעבדה מורכבות.

תוצאות:

1. סקירת נדיפים

סקירה מקיפה של חומרים נדיפים נעשתה בתהליך שכלל שימוש במערכת GC-MS (כרומטוגרפיה גזית בשילוב ספקטרומטריית מסות) לצורך זיהוי תרכובות ספציפיות תוך איסוף ממנדרינות נגועות בזחלי עש התפוח המדומה בהשוואה למנדרינות תקינות. תוצאות הסקירה הראו כי Ethyl Caprylate ,Methyl Octanoate ו-Ethyl Caprate  היו הנדיפים בעלי הביטוי הגבוה ביותר בפירות הנגועים והופיעו באופן ספציפי בפירות נגועים בלבד, בעוד שבפירות התקינים הם נעדרו או הופיעו ברמות זניחות.

1. בחירת ריכוז נדיפים פעיל

לצורך בחינת ריכוז נדיפים פעיל, ריכוזים שונים של הנדיפים שנבחרו גודלו עם חיידקי E. coli  מזן DH5α בשלב הצמיחה הראשוני ,(OD600 nm = 0.1) ולאחר מכן נמדדה עקומת צמיחת החיידקים באמצעות קורא מיקרופלטות למשך 8.5 שעות. נמצא כי ריכוזי נדיפים של 200 PPM עבור כל הנדיפים שנבדקו לא השפיעו על צמיחת החיידקים, עם עקומות צמיחה כמעט חופפות לאלו של קבוצת הביקורת. ריכוז זה נקבע כריכוז התת-מעכב המומלץ לניסויים נוספים (איור 1).  בשלב ראשון יש צורך בזיהוי פרומוטורים בתאי החיידקים, המגיבים לנדיפים שנבחרו על-ידי קביעת ריכוז הנדיפים שגורמים לתגובה בתאי החיידקים. תגובה זו נדרשה להיות ברמה שאינה חזקה מדי כדי לעכב את צמיחת החיידקים, אך גם לא נמוכה מדי כדי שלא תשפיע על הרגולציה הגנטית בתאי החיידקים. התהליך נעשה באופן ספציפי עבור כל נדיף שנבדק באמצעות טכניקות ריצוף מתקדמות.

1. ביטוי הגנים המשמעותיים תחת השפעת הנדיפים

גרף וולקנו (volcano)  מציג את השינוי בביטוי הגנים המשמעותיים ביותר תחת טיפול בנדיפים כפי שניתן לראות באיור 2.

דפוס הביטוי של הגנים מוצג באמצעות גרף volcano עם קלאסטרינג היררכי .נמצא כי שלושת הנדיפים שנבדקו גרמו כל אחד לדפוס תגובה שונה בE. coli – וכן לדפוס ייחודי בהשוואה לקבוצת הביקורת, שכללה חיידקים שלא נחשפו לחומרים אלה. השונות בדפוסי הביטוי התבטאה הן בהרכב הגנים המושפעים והן במידת השינוי בביטוי. דפוסי הביטוי הייחודיים שנגרמו על ידי כל אחד מהנדיפים עשויים לשמש בסיס מדעי לזיהוי ולסיווג חומרים כימיים.

במשך המחקר ייבחנו החיידקים המהונדסים בסביבה יישומית, שבה ייחשפו לאוויר שנפלט ממנדרינות נגועות בזחלי עש התפוח המדומה, בהשוואה למנדרינות לא נגועות.

מקורות

[1] משרד החקלאות ופיתוח הכפר שירות ההדרכה והמקצוע תחום הגנת הצומח פברואר 2016. פרוטוקול לניטור ולהדברה של עש התפוח המדומה. ד"ר שאול בן יהודה וחבוריו  משרד החקלאות ופיתוח הכפר, בית דגן.

https://www.moag.gov.il/shaham/ProfessionalInformation/Pages/protokol_false_codling_moth_2016.aspx

[2] משרד החקלאות ופיתוח הכפר שירות ההדרכה והמקצוע אוגוסט 2017. עש התפוח המדומה בהדרים- התמודדות, מניעה והדברה. לאה סלע וחובריה

https://www.moag.gov.il/shaham/ProfessionalInformation/Pages/false_codling_moth_august_2017.aspx

[3] E. Eltzov, R.S. Marks, Fiber-optic based cell sensors,  Whole Cell Sensing Systems I, Springer2009, pp. 131-54.

[4] E. Eltzov, R.S. Marks, Whole-cell aquatic biosensors, Analytical and Bioanalytical Chemistry, 400 (2011) 895-913.

[5]   E. Eltzov, A. Cohen, R.S. Marks, Bioluminescent liquid light guide pad biosensor for indoor air toxicity monitoring, Analytical Chemistry, 87 (2015) 3655-61.

[6]   E. Eltzov, V. Pavluchkov, M. Burstin, R.S. Marks, Creation of a fiber optic based biosensor for air toxicity monitoring, Sensors and Actuators B-Chemical, 155 (2011) 859-67.

  [7] E. Pichersky, J.P. Noel, N. Dudareva, Biosynthesis of Plant Volatiles: Nature’s Diversity and Ingenuity, Science (New York, NY), 311 (2006) 808-11.

[8] L. Arnaud, et al., Is Dimethyldecanal a Common Aggregation Pheromone of Tribolium Flour Beetles?, Journal of Chemical Ecology, 28 (2002) 523-32.

[9] M.L. Villaverde, M.P. Juárez, S. Mijailovsky, Detection of Tribolium castaneum (Herbst) volatile defensive secretions by solid phase microextraction–capillary gas chromatography (SPME-CGC), Journal of Stored Products Research, 43 (2007) 540-5.