בחינת התכנות מעבדתית ליעילות פונגצידים המצויים בשוק המסחרילהתמודדות עם מחלת הכתמת (צרקוספורה) בסלק אדום

מיכל דפני ונדב ניצן^†
היחידה לפיטופתולוגיה, מו"פ עמק המעיינות

^† מחבר להתקשרות: ד"ר נדב ניצן, [email protected]

תמונה ראשית: סלק. צילום מארק שולנבורג

תקציר

כתמת הסלק, הנגרמת על-ידי הפטרייהCercospora beticola  היא מחלה הרסנית בגידול סלק אדום בישראל, אך סל התכשירים המורשים להדברתה מצומצם ומבוסס בעיקר על דיפנוקונאזול. מטרת המחקר הייתה לפתח מערכת מבוקרת להשלמת מעגל המחלה ולבחון יעילות של פונגיצידים מסחריים נוספים. המחקר פיתח בהצלחה מערכת אילוח בצמח השלם, המבוססת על ריסוס תרחיף מקטעי תפטיר הפטריה, הדגרה בלחות מלאה ולאחריה מחזורי הרטבה וייבוש. בביקורת המאולחת התפתחה חומרת מחלה ממוצעת של כ-50%. מירביס פריים, בוגירון ולונה טרנקיליטי היו התכשירים היעילים ביותר והפחיתו במובהק (P<0.05) את חומרת המחלה ב-99.5%, 88% ו-68%, בהתאמה. מערכת הסריקה המעבדתית שפותחה אפשרה הבחנה ברורה בין תכשירים בעלי יעילות גבוהה, בינונית ונמוכה. התוצאות מצביעות על פוטנציאל להרחבת סל התכשירים ולגיוון מנגנוני הפעולה, החשובים במיוחד לניהול עמידות. עם זאת, מדובר בסינון ראשוני בתנאים מבוקרים, ולכן נדרש להמשיך בניסויי שדה לבחינת יציבות היעילות, השפעת תנאי הסביבה, תזמון היישומים והשפעת הטיפולים על חומרת המחלה, היבול ואיכותו בגידול בתנאים מסחריים, במספר אתרים ועונות ובהשוואה לסטנדרט המסחרי ולביקורת לא מטופלת.

מבוא

כתמת הסלק (כתמי צרקוספורה; Cercospora Leaf Spot), היא מהמחלות הפחות נחקרות בישראל והידע הפיטופתולוגי מסתכם במחקרים משנות ה-60 וה-70 של המאה הקודמת (גוטשטיין וכרמלי, 1963; סולל וכהן, 1971). מדובר במחלה שפחיתת היבול שהיא גורמת לסלק מוערכת על-ידי התעשיה בישראל בין 10% ל-100%. הפתוגן גורם המחלה היא הפטריה צרקוספורהCercospora beticola) ), המייצרת מחלה פוליציקלית, שתסמיניה מתבטאים בנגעים, עגולים ("כתמים"), בצבע אפור-חום עם שוליים אדמדמים או כהים (איור 1 א), אשר במקרים חמורים מתמזגים, גורמים להתמוטטות העלווה ומייצרים מוקד נגיעות, המהווה מקור מדבק להדבקות משניות והתפשטות המחלה בשדה (איור 1 ב).

איור 1. כתמת (צרקוספורה) בסלק: (א) תסמיני המחלה מופיעים ככתמים על גבי שטח העלה; (ב) עלים נגועים בחומרה גבוהה המהווים מוקד ומקור מדבק להדבקות משניות.

הפחתת שטח העלים מצמצמת את היכולת הפוטוסינתטית, ומאמץ הפיצוי של הצמח ליצירת עלווה חדשה פוגע בהתפתחות שורש הסלק באופן חמור. כך, שבסוף העונה, במידה והשדה לא קרס, נאספים שורשים, שגודלם קטן ואינו בר-שיווק. בשדות נגועים קשות בעולם דווחו ירידות ביבול של כ-50% (Skaracis et al. 2000). המחלה נחשבת מחלת קיץ ומתפתחת בתנאי סביבה חמים (24-30 מ"צ) ולחים, במיוחד כאשר קיימת לחות יחסית מעל 85% למשך שעות רבות ביום. תנאים אלו מתקיימים בעמק המעיינות ובעמק יזרעאל בתקופת הגידול הקייצית (יוני – אוקטובר). נבגי הפטריה מתפתחים בנגעי העלווה (איור 2) ומופצים על-ידי רוח והתזת מי-השקייה מממטרות ומייצרים מוקדי הדבקה מרובים בשדה. הנגעים הראשונים מופיעים לרוב לאחר סגירת שורות הנוף, כאשר הלחות במיקרואקלים התוך-עלוותי עולה ושעות רטיבות העלה מתארכות. בהיעדר הדברה יעילה, מחזורי הדבקה מרובים מאפשרים את התפשטות המחלה וגורמים לקריסת שטחים נרחבים בשדה.

ממשק הדברת המחלה בישראל מבוסס על שימוש בפונגיצידים מסחריים הניתנים בריסוס עלוותי. כיום מותרים לשימוש התכשירים הבאים לפי הנחיות השירותים להגנת הצומח (PPIS): בוגירון, סקוטר, סקור וסקיפר – המכילים את הפונגציד דיפנוקונאזול (מקבוצת DMI); מירדור – המכיל את הפונגציד אזוקסיסטרובין (מקבוצת QoI); ופרימיום – המכיל תערובת של בוסקליד + אזוקסיסטרובין (מהקבוצות DSHI ו-QoI). כלומר, 3 חומרים פעילים משלוש קבוצות כימיות שונות בלבד. זהו מגוון מצומצם מאוד של חומרים פעילים הנמצא בשימוש שנים רבות ואינו מספק כיום מענה מספק להדברת המחלה, כך שבכל עונה המחלה מתפשטת לכדי אפידמיה. לפיכך, מטרת המחקר היתה לפתח, תחת תנאי מעבדה, פרוטוקול להשלמת מעגל המחלה, ולהתמקד בבחינת יעילותם של תכשירי הדברה נוספים וחדשים הקיימים בשוק בבחנים ביולוגיים בצמח השלם, תחת תנאי גידול מבוקרים. זאת בכדי לאפשר ביצוע ניסויי שדה ממוקדים לקידום תכשירים יעילים ורישויים.

שיטות וחומרים

תרבית צרקוספורה. עלים נגועים במחלה נאספו בשדה סלק מסחרי בעמק יזרעאל והועברו למעבדה. העלים נשטפו היטב במי ברז והודגרו בצלחות פטרי על גבי מגבת נייר רטובה בחושך בטמפרטורה של 24 מעלות צלסיוס (מ"צ). לאחר 72 שעות נצפתה הנבגה עשירה בשולי הנגעים. מסת נבגים הועברה לצלחת פטרי וממנה בודד למצע גידול מסוג PDA 1% נבג יחיד ליצירת תרבית טהורה חד-ניבגית (איור 2).

איור 2. צילום מיקרוסקופי של נבגי צרקוספורה. (א) התפתחות הנבגים על-גבי הכתם בדיסקית עלה שהונחה בצלחת פטרי על גבי אגר מים והודגרה למשך 72 שעות בחושך ב- 24 מ"צ. ניתן להבחין במסה שנראית כמו זיפים; (ב) צבר של נבגי הפטריה בהגדלה מיקרוסקופית של 40X. הנבגים צרים ומאורכים ונראים כמו שערות.

השפעת טמפרטורה על גידול הפטריה. דיסקיות אגר מאוכלס בפטריה הועברו למצע PDA 1% והונחו במרכזו. הפטריה הודגרה ב-5, 10, 15, 20, 25, 30 ו-35 מ"צ בחושך. לאחר 10 ימי הדגרה נמדד קוטר המושבה וחולק במספר ימי ההדגרה לקבלת קצב הגידול הלינארי. הניסוי הוצב עם 3 חזרות לטמפרטורה.

בחנים ביולוגיים ליעילות תכשירים. צרקוספורה אינה מנביגה בספונטניות במצע גידול. לכן, מקטעי אגר מאוכלס הועברו למצע גידול נוזלי מסוג PDB 1% וגודלו בחושך בשקשוק ב-24 מ"צ למשך 10 ימים. המדבק סונן דרך בד גזה, נשטף במים מזוקקים סטריליים ונטחן במעבד מזון (בלנדר) למשך 30 שניות ב-500 מ"ל מים, לקבלת תרחיף מקטעי תפטיר של הפטריה. התרחיף אוזן לריכוז של 10⁴ מקטעי תפטיר למ"ל מים מזוקקים בעזרת המוציטומטר.

תכשירי הדברה קוטלי פטריות נתקבלו מהחברות המסחריות לבדיקה. הפונגצידים נמהלו במים מזוקקים לריכוז המטרה המומלץ כמופיע בטבלה 1.

טבלה 1

התכשירים רוססו על גבי צמחי סלק בני חודש וחצי עד נגר, בעזרת מרסס יד 50 מ"ל והועברו לייבוש למשך 24 שעות בחדר הגידול (24 מ"צ, 60% לחות), שלאחריו רוססו בתרחיף הפטריה לכיסוי מלא עד נגר של העלווה והועברו למשך 48 שעות להדגרה בתא עירפול (100% לחות) בחושך ב-24 מ"צ. בהמשך הצמחים נחשפו במשך 12 ימים לסידרת ייבוש והרטבת העלווה – פרוטוקול שפותח באופן ייחודי במעבדה לפיטופתולוגיה במו"פ עמק המעיינות על מנת להשלים את מעגל המחלה. הניסויים במעבדה אורגנו במבנה אקראי מלא עם 4 או 5 חזרות (עציץ) לכל טיפול פונגצידי, כולל ביקורת מים. נגיעות הצמחים הוערכה כשבועיים לאחר אילוח באופן חזותי, כאחוז (%) השטח העלוותי הנגוע. בוצעו שלושה ניסויים חוזרים והנתונים נותחו סטטיסטית בעזרת מבחנים לשונות מסוג ANOVA והפרדת ממוצעים עם מבחן Dunnett's בהשוואה לביקורת מים.

תוצאות

השפעת טמפרטורה על גידול הפטריה. קצב הגידול הרדיאלי in vitro של פטריית הצרקוספורה, שבודדה מסלק בעונת 2025 משדה מסחרי בעמק יזרעאל, נבחנה בסדרת טמפרטורות של 5 – 35 מ"צ. מודל בריאר (Brie'r Growth Model) חישב שטווח טמפרטורות הגידול המיטבי הינו בין 25 ל-30 מ"צ, עם טמפרטורת אופטימום של 27 מ"צ,  טמפרטורת מינימום של 2.8 מ"צ, וטמפרטורת מקסימום של 33.4 מ"צ לגידול (איור 3). טמפרטורות גידול מיטביות אלו מתאימות לתזמון התפרצות המחלה בשדה בעונת הגידול הקיצית, ומסבירה את יכולת הפטריה לייצר מחלה לאורך כלל עונות השנה.

איור 3. מודל בריאר (Brie'r Model) המתאר את השפעת הטמפרטורה על קצב הגידול הרדיאלי של פטריית צרקוספורה. המודל מחשב טווח טמפרטורות גידול מיטבי בין 25 ל- 30 מ"צ, עם טמפרטורת אופטימום של 27 מ"צ.

פיתוח מערכת אילוח והשלמת מעגל המחלה בתנאים מבוקרים. במסגרת המחקר פותחה בהצלחה מערכת מבוקרת להדבקת צמחי סלק בצרקוספורה ולהשלמת מעגל המחלה בתנאי מעבדה. לצורך הכנת המדבק גודלה הפטרייה במצע נוזלי, הוכן תרחיף מקטעי תפטיר וצמחי הסלק אולחו לאחר ריסוס מקדים בתכשירי ההדברה. לאחר האילוח הוחזקו הצמחים במשך 48 שעות בתנאי 100% לחות ובטמפרטורה של 24 מ"צ, ולאחר מכן נחשפו למשטר מחזורי של הרטבה וייבוש שפותח במעבדה לצורך השראת המחלה. מערכת האילוח אפשרה התפתחות ברורה של כתמי צרקוספורה אופייניים על גבי העלים (איור 4) והתקדמות המחלה לרמות שאפשרו להבחין בין טיפולי הפונגיצידים. הצלחת האילוח והדירותו מהוות שלב מרכזי במחקר, מאחר שהן מאפשרות לבצע סינון מבוקר ומהיר יחסית של תכשירים מסחריים לפני מעבר לניסויי שדה מורכבים ויקרים יותר.

איור 4. התפתחות נגעי צרקוספורה בעלי סלק לאחר אילוח יזום והשלמת מעגל המחלה במעבדה בתנאים מבוקרים. תהליך האילוח מתבצע בעזרת תרחיף מקטעי תפטיר לאור יכולת נמוכה של הפטריה להנביג במצע גידול. השלמת מעגל המחלה דורש סדרת חשיפות לתנאי רטיבות עלה ויובש.

חומרת המחלה ויעילות התכשירים. חומרת המחלה הוערכה שבועיים לאחר אילוח כאחוז השטח העלוותי הנגוע. בביקורת המאולחת ללא פונגיציד (UTC) התפתחה חומרת מחלה ממוצעת של 46.9%. בין התכשירים שנבדקו נמצאה שונות מובהקת (P<0.05) ברמת ההגנה על הצמחים, החל מטיפולים שבהם חומרת המחלה הייתה דומה לזו של הביקורת ואף גבוהה ממנה, ועד לתכשירים, שבהם התפתחות המחלה צומצמה במידה ניכרת או כמעט נמנעה לחלוטין (איור 5).

איור 5. חומרת כתמי עלים שהתפתחו בצמחי סלק, שרוססו בתכשירי הדברה לפי ממשק מונע ואולחו בתרחיף צרקוספורה 24 שעות לאחר טיפול פונגצידי. חומרת המחלה הוערכה 14 ימים לאחר אילוח. צמחים שרוססו בתכשירים המסומנים בקו שחור מעליהם הדגימו פחות מחלה מהביקורת הלא מאולחת במובהק (P<0.05) בשלושה ניסויים חוזרים.

הטיפול הבולט ביותר (P<0.0001) היה מירביס פריים (איור 6 א), שבו חומרת המחלה הממוצעת הייתה 0.22% בלבד, המקבילה לכ-99.5% הדברה ביחס לביקורת המאולחת. בוגירון, המבוסס על דיפנוקונאזול ומשמש כתכשיר מסחרי מקובל נגד המחלה, הפחית את חומרת המחלה ל-5.69%, שהם כ-88% הדברה. לונה טרנקיליטי הפחית את חומרת המחלה ל-15.2% שהם 68% הדברה (איור 6 ב). התכשיר פרימיום גם כן הפחית מחלה באופן ניכר, אולם לא במובהק מביקורת המים. בסיכום שלב הסינון הודגם כי מערכת המבחן המעבדתית מאפשרת להבחין בצורה ברורה בין תכשירים בעלי פוטנציאל גבוה, בינוני ונמוך להדברת המחלה.

איור 6. תמונות מייצגות ליעילות מירביס פריים (א) ולונה טרנקיליטי (ב) בהשוואה לביקורת לא מטופלת.

דיון

מטרת העבודה הנוכחית היתה לפתח מערכת מבוקרת לאילוח צמחי סלק עם צרקוספורה ולהשלים את מעגל המחלה בתנאי מעבדה, במטרה לסנן פונגיצידים בעלי פוטנציאל להדברת כתמת הסלק לניסויי שדה. מטרה זו הושגה. הצלחת השלמת מעגל המחלה בתנאים מבוקרים והיכולת לקבל נגיעות משמעותית בביקורת לצד הבדלים ברורים בין טיפולי הפונגיצידים מספקות בסיס מתודולוגי להמשך המחקר.

ממצאי ניסוי קצב הגידול מחזקים את הקשר בין דרישות הטמפרטורה של Cercospora beticola  לבין העונתיות של המחלה בתנאי השדה. טווח הגידול המיטבי שנמצא, 25–30 מ"צ, וטמפרטורת האופטימום שחושבה, 27 מ"צ, חופפים לתנאי הקיץ השוררים באזורי גידול הסלק בתקופה שבה נצפית התפרצות המחלה העיקרית, מיוני ועד אוקטובר. התאמה זו תומכת בכך שטמפרטורה היא גורם סביבתי מרכזי התורם להתפתחות הפתוגן ולהתקדמות המחלה, וכי העלייה בטמפרטורות בתחילת הקיץ עשויה ליצור תנאים נוחים יותר להתבססות ולהתרבות הפטרייה. עם זאת, קצב גידול רדיאלי in vitro משקף את התפתחות התפטיר בתרבית ואינו שקול בהכרח לתהליך ההדבקה בצמח. לכן, יש לראות בתוצאה זו בסיס אפידמיולוגי תומך להבנת עונתיות המחלה, שאותו יש לשלב בהמשך עם בחינת השפעת הטמפרטורה על נביטה, הדבקה והתפתחות תסמינים בתנאים מבוקרים ובשדה.

חשיבות תוצאות המחקר עולה במיוחד לנוכח סל התכשירים המצומצם הקיים כיום בישראל. לרשות המגדלים יש היום שישה תכשירים מורשים על-ידי השירותים להגנה"צ, אלו הם: בוגירון, סקוטר, סקור וסקיפר המבוססים למעשה על אותו חומר פעיל – דיפנוקונאזול, מקבוצת מעכבי הדה-מתילציה (DMI). שני התכשירים האחרים מבוססים על אזוקסיסטרובין או על תערובת של בוסקליד ואזוקסיסטרובין. לפיכך, אף שקיימים לכאורה שישה תכשירים מסחריים, המגוון האמיתי מסתכם בשלושה חומרים פעילים בלבד ובמספר קטן של מנגנוני פעולה, כאשר אזוקסיסטרובין מוכר כחומר פעיל עם רגישות גבוהה לשבירת עמידות. כשלי השדה בהדברת המחלה מרמזים שמגוון התכשירים הקיים אינו מספק להתמודדות עם גורם מחלה זה.

קבוצת  ה-DMIs, בכללה טריאזולים כדוגמת דיפנוקונאזול, מהווה במשך שנים את עמוד התווך המרכזי בהדברה הכימית של צרקוספורה בסלק. מחקרי שדה בינלאומיים הראו כי תכשירי DMI יכולים לספק רמת הדברה גבוהה של כתמי צרקוספורה, ולעיתים הם נכללים בין הרכיבים היעילים ביותר בתכניות ההדברה של המחלה. בהתאם לכך, גם בניסוי הנוכחי בוגירון, המכיל דיפנוקונאזול, היה אחד מהטיפולים היעילים ביותר. עם זאת, הסתמכות ממושכת על אותה קבוצה כימית יוצרת נקודת תורפה משמעותית.

אוכלוסיות של צרקוספורה בעלות רגישות מופחתת ועמידות ל- DMIs תועדו באזורים שונים בעולם (Karaoglanidis et al., 2000), והירידה ברגישות לקבוצה זו נחשבת כיום לאחד האתגרים המרכזיים בניהול המחלה. מכאן שהמצב בישראל, שבו מרבית התכשירים המורשים מבוססים על דיפנוקונאזול, אינו רק מגביל מבחינת אפשרויות ההדברה אלא גם מקשה על ביצוע רוטציה אמיתית בין מנגנוני פעולה ועל יישום ממשק בר-קיימא לניהול עמידות. בהקשר זה, התוצאה החשובה ביותר של המחקר אינה רק מציאת תכשיר אחד שהדגים יעילות גבוהה, אלא זיהוי של מספר אפשרויות כימיות נוספות בעלות פוטנציאל משמעותי להרחבת סל ההדברה, קרי: מירביס-פריים ולונה טרנקיליטי המשלבים קבוצות כימיות מקודי FRAC שונים. קידום תכשירים אלו עשוי, בכפוף לאימות יעילותם בשדה, לאפשר בניית ממשק המבוסס על מספר קבוצות כימיות ולא על שימוש חוזר כמעט בלעדי בדיפנוקונאזול.

יחד עם זאת, יש להתייחס לתוצאות הנוכחיות כתוצאות של שלב סינון ראשוני בלבד. תנאי חדר הגידול מאפשרים יצירת לחץ מחלה מבוקר וחשיפה אחידה של הצמחים והפתוגן לפונגיציד, אך אינם משקפים במלואם את התנאים בשדה. יעילותו המעשית של תכשיר מושפעת מתנאי הסביבה, קצב צימוח העלווה, כיסוי הריסוס, דעיכת שאריתיות התכשיר, לחץ ההדבקה, מספר מחזורי המחלה והצורך בריסוסים חוזרים לאורך עונת הגידול. לפיכך, אין להסיק מתוצאות המבחן המעבדתי על יעילות מסחרית סופית או על התאמה לרישוי ללא אימות בתנאי שדה. בהתאם לכך, השלב הבא במחקר צריך להתמקד בניסויי שדה עם התכשירים שנמצאו מבטיחים ביותר. בניסויים אלה יש להשוותם לדיפנוקונאזול כסטנדרט מסחרי, לצד ביקורת לא מטופלת, ולבחון את התפתחות המחלה לאורך העונה, את יציבות היעילות במספר מועדי יישום ובתנאי לחץ מחלה שונים, ובהמשך גם את השפעת הטיפולים על שמירת שטח העלווה ועל מדדי יבול ואיכות.

לסיכום, המחקר הצליח להקים מערכת אילוח מבוקרת להשלמת מעגל המחלה של צרקוספורה בסלק וליישם אותה ככלי יעיל לסינון פונגיצידים. מתוך מגוון התכשירים שנבדק זוהתה קבוצת תכשירים מצומצמת בעלת פוטנציאל, המספקת בסיס ישיר לבחירת התכשירים לניסויי השדה הבאים. הרחבת סל התכשירים חשובה במיוחד לנוכח המספר המצומצם של חומרים פעילים המורשים כיום בישראל וההסתמכות הרבה על דיפנוקונאזול מקבוצת ה- DMI. אימות התוצאות בשדה הוא לפיכך השלב הנדרש כדי לבחון האם ניתן לתרגם את היעילות שנמצאה במערכת המבוקרת לממשק הדברה יעיל, מגוון ובר-קיימא בתנאי גידול מסחריים.

ספרות

1. Skaracis, G.N.; Biancardi, E. Breeding for Cercospora resistance in sugar beet. In Advances in Sugar Beet Research Volume 2: Cercospora beticola Sacc. Biology, Agronomic Influence and Control Measures in Sugar Beet; Asher, M.J.C., Holtschulte, B., Richard Molard, M., Rosso, F., Steinruecken, G., Beckers, R., Eds.; International Institute for Beet Research: Brussels, Belgium, 2000; pp. 177–195.
2. Karaoglanidis, G.S., Ioannidis, P.M., & Thanassoulopoulos, C.C. (2000). Reduced sensitivity of Cercospora beticola isolates to sterol demethylation-inhibiting fungicides. Plant Pathology, 49, 567–572.
3. צבי סולל ועמיחי כהן. 1971. הדברת צרקוספורה בסלק סוכר בפונגצידים סיסטמיים. "השדה", כרך נ"א. https://volcaniarchive.agri.gov.il/skn/Public/28f9073c659f4353aae47b7cf1bc671c.
4. יצחק גוטשטיין וראובן כרמלי. 1963. תכיפות ועיתוי של טיפולים נגד צרקוספורה והשפעתם על כושר ההנבה של סלק הסוכר ואיכותו. "השדה", כרך מ"ג, ע' 968-970. https://volcaniarchive.agri.gov.il/skn/Public/c3f7aa9d86354158883ca7aab4f897cf.

*התוצאות המוצגות במסמך זה אינן מהוות המלצה לשימוש מסחרי על-ידי המגדלים*