"בקיץ הזה תלבשי לבן" – מופע הצבע הלבן בקליפת פרי המלון קשור בצבירה של שעוות

רן עזר^1,2,3, יקטרינה מנשרובה¹, יעקב תדמור², וחגי כהן¹

¹ המחלקה לחקר ירקות וגידולי שדה, המכון למדעי הצמח, מנהל המחקר החקלאי, מכון וולקני.

² היחידה לדלועיים, מרכז המחקר נווה יער, מנהל המחקר החקלאי, מכון וולקני.

³ הפקולטה לחקלאות מזון וסביבה ע"ש רוברט ה. סמית, האוניברסיטה העברית בירושלים.

תקציר

צבעה החיצוני של קליפת הפרי מהווה אינדיקטור משמעותי לאיכות, ועל כן משפיעה ישירות על בחירת הצרכן. צבע הקליפה מושפע מיצירה של פיגמנטים מקבוצות ביוכימיות מגוונות, כמו גם משעוות שמיוצרות על ידי הקליפה ונצברות על פני השטח ומקנות לה גוון לבן-אפרפר. מלון, השייך למשפחת הדלועיים ומהווה אחד מהגידולים החקלאיים החשובים בארץ ובעולם, מציג מגוון פנוטיפי רחב בצבע הקליפה שכולל לבן, צהוב, כתום, וירוק, בגוונים שונים. קליפה לבנה במלון הינה תכונה רצסיבית הנשלטת על ידי גן רצסיבי יחיד המונע הצטברות כלורופיל או קרוטנואידים בקליפה. ממצאי מחקרים קודמים הציעו כי מופע הקליפה הלבן, בזנים מסוימים של מלון כמו למשל מלון 'שרנטה', הינו תכונה דומיננטית שעוברת בתורשה כגן יחיד. במחקר השוואתי זה בין זני מלון בעלי מופע קליפה לבן או ירוק, אנו מראים בעזרת כלים מיקרוסקופיים וביוכימיים כי קליפת פרי המלון הינה מקור עשיר לשעוות וכי מופע הקליפה הלבן הדומיננטי, קשור בצבירה שעוות מקבוצות ביוכימיות ספציפיות על גבי הקליפה. תוצרי המחקר שלנו כוללים ידע ביוכימי וחומר צמחי שיקדמו את זיהוי  הגן שאחראי למופע הקליפה הלבן הדומיננטי בפרי המלון, ומרחיבים את ההבנה של השונות הטבעית הקיימת בצבע קליפת זני מלון.

מבוא

הצבע החיצוני של קליפת הפרי משפיע ישירות על העדפת הצרכן וכתוצאה מכך על ערכו הכלכלי של הפרי ושיווקו. לרוב, צבע הקליפה נקבע על ידי יחסי גומלין בין מסלולי הייצור של פיגמנטים שונים כגון אנתוציאנינים, קרוטנואידים וכלורופיל הנצברים בקליפת הפרי. אולם מלבד פיגמנטים אלה מחקרים הראו כי הצטברות של שעוות על גבי קליפת הפרי תורמת גם היא לצבע קליפה  בגווני לבן-אפרפר. שעוות מורכבות מחומצות שומן ארוכות עם למעלה מ-20 פחמנים מקבוצות ביוכימיות שונות, כגון, אלכוהולים ראשוניים ומשניים, אלדהידים, אלקנים, קטונים ואסטרים של שעווה. לאופי ההידרופובי והתכונות הביוכימיות של השעוות השפעה ניכרת על התכונות האופטיות (בהירות, ברק, צבע) של קליפת הפרי. זני פרי המלון, השייך למשפחת הדלועיים שהיא בעלת חשיבות חקלאית גדולה, מציגים שונות גדולה בצבע הקליפה הכוללת  לבן, צהוב,, כתום, וירוק, בגוונים שונים ובשילובים ביניהם. הפיגמנטים האחראים לצבעי הקליפה השונים בזני פרי המלון הם קרוטנואידים, כלורופילים ופלבנואידים. 

ממצאי מחקרים קודמים מצביעים כי באוכמניות, שזיפים, ענבים ותפוחים, הצטברות של שעוות על גבי קליפת הפרי קשורה באופן ישיר לצבעה הלבן הנראה כמעין ציפוי לבן-אפרפר. במלון ישנו מגוון זנים מסוימים בעלי מופע קליפה לבן שהוכח כתכונה דומיננטית שמופתה גנטית לאזור בכרומוזום 7 והוצע כי הוא עובר בתורשה כגן יחיד. אולם, לא זוהו ו/או אופיינו באזור זה גן/גנים המעורבים במסלולי הייצור של שעוות ולא נעשתה אנליזה ביוכימית מקיפה לקליפה הלבנה. על כן, תכונה זו במלון לא נקשרה עד כה להצטברות של שעוות על גבי קליפת הפרי.

במאמר זה רצינו לבחון האם מופע הצבע הלבן בפרי המלון קשור להצטברות של שעוות על גבי קליפת הפרי. בחרנו לעבוד עם ארבעה זני מלון שמציגים מופע קליפה לבן או ירוק, שהם חלק מאוסף זנים הנקרא MelonCore25 שפותח ביחידת הדלועיים במרכז המחקר נווה יער. אוסף זה כולל 25 זני מלון המייצגים את השונות הגנוטיפית והפנוטיפית של זני המלון. בעזרת כלים מיקרוסקופיים ביצענו השוואה מורפולוגית בין קליפת פירות בעלי מופע לבן לקליפת פירות בעלי מופע ירוק, וכן בין דפוסי הצטברות השעוות על גבי הקליפה. בנוסף, ביצענו ניתוח ביוכימי של הרכב השעוות שהצטברו על קליפת פירות בוגרים של ארבעת הזנים בעזרת כלים מעולם הכימיה האנליטית. למיטב ידיעתנו סיפקנו במחקר זה בפעם הראשונה את הפרופיל של שעוות בקליפת פרי המלון, והראנו כי היא מהווה מקור עשיר לשעוות מקבוצות ביוכימיות שונות. יתר על כן, הראנו כי הפירות בעלי מופע הקליפה הלבן צברו רמות גבוהות של אלקנים, אלכוהולים, טוקופרולים, אלדהידים ואסטרים. בהתבסס על ממצאים אלה, אנו מציעים כי התכונה הדומיננטית לצבע קליפה לבן בקליפת פרי המלון נגרמת מהצטברות מוגברת של שעוות על גבי קליפת הפרי ולכן היא קשורה באופן ישיר או עקיף למסלולי הייצור של שעוות.

שיטות וחומרים

החומר הצמחי

במסגרת המחקר נבחנו ארבעה זני מלון: שני זנים בעלי קליפה לבנה ברורה, VEP ו-NDD1 השייכים לקבוצת המינים Cantalupensis, ושני זנים בעלי קליפה ירוקה, TVT השייך לקבוצת המינים Inodorus ו-DUL השייך לקבוצת המינים Reticulatus. הצמחים גודלו בתנאי שדה טבעיים ובמשטרי השקיה ודישון רגילים בחממות של חברת אוריג'ין זרעים במושב בני-דרום, ישראל. האנליזות המיקרוסקופיות והביוכימיות בוצעו במעבדתי שבמכון וולקני על קליפת פירות בוגרים מארבעת הזנים.  

אפיון מיקרוסקופי של קליפת הפרי ומבנה השעוות

על מנת לבחון את ההבדלים המורפולוגיים ובצבע הקליפה בחנו דגימות של קליפת פירות ארבעת הזנים הנחקרים תחת בינוקולר Olympus SZX7 ותמונות צולמו באמצעות מצלמה דיגיטלית Pixelink PLD795CU. בכדי לבחון את צפיפות גבישי השעווה ואת המבנה של הגבישים ברזולוציה גבוהה, דסקיות קליפה הוסרו בעדינות מפירות ארבעת הזנים, קובעו על גבי מחזיק דגימות של מיקרוסקופ אלקטרונים סורק, יובשו למשך כשבוע, ולבסוף צופו בשכבה של שני ננומטר של חלקיקי Au/Pd באמצעות מכשיר Quorum Q150TES. דוגמאות הקליפה נצפו תחת מיקרוסקופ אלקטרונים סורק מהדגם JEOL 7800 FEG SEM.

אפיון ביוכימי של תכולת והרכב השעוות על ידי כרומטוגרפיה גזית

תכולת והרכב השעוות בקליפת פירות בוגרים מארבעת הזנים בודדו מדסקיות קליפה בקוטר 0.8 ס"מ שנטבלו למשך 30 שניות ב-5 מ"ל תמיסת כלורופורם המכילה אלקן בעל 36 פחמנים כסטנדרט פנימי לטובת נרמול תוצאות האנליזה בכל אחת מהדוגמאות. דוגמאות הכלורופורם המכילות את השעוות שמוצו מהקליפה אודו לחלוטין תחת זרם חנקן והורחפו ב-100 מיקרוליטר כלורופורם טרי. הדוגמאות עברו דריוטיזציה על ידי הוספת 20 מיקרוליטר פירידין ו-20 מיקרוליטר BSTFA, וחוממו ל-70 מ"צ למשך שעה באינקובטור יבש. לאחר קירור הדוגמאות, תכולתן הועבר למבחנות הרצה, ופרופיל השעוות נותח על ידי הפרדה במכשיר כרומטוגרפיה גזית משולבת ספקטרוסקופיית מסות (GC-MS) בהתאם לפרוטוקולים ייעודיים שפותחו במעבדתנו. לצורך זיהוי אבני הבניין של השעוות, ספקטרום המסות של הדוגמאות הנבדקות הושווה לספריית NIST20 וכן לספריות ספקטרליות שפותחו במעבדתנו.

תוצאות ודיון

אפיון מיקרוסקופי של קליפת הפרי ומבנה השעוות

על מנת לבחון האם מופע הקליפה הלבן בפרי המלון קשור להצטברות של שעוות על גבי הקליפה, בחרנו לעבוד על שני הזנים VEP ו-NDD1 בעלי קליפה לבנה ברורה, ושני הזנים TVT ו-DUL בעלי קליפה ירוקה (איור 1). בשל גודלן הקטן של השעוות הנצברות על גבי הקליפה במבנה של גבישים, עשינו שימוש במיקרוסקופ אלקטרונים סורק על מנת לבחון את צפיפות גבישי השעווה על גבי קליפת פירות ארבעת הזנים, וכן את צורת הגבישים עצמם. התצפיות המיקרוסקופיות הצביעו על הבדלים ברורים בצפיפות גבישי השעווה בין פירות ארבעת הזנים, כאשר הזנים VEP ו-NDD1 בעלי מופע הקליפה הלבן היו מכוסים בצפיפות גבוהה מאד של גבישים, ואילו מעט מאד שעוות נראו על גבי קליפת פירות הזנים TVT ו-DUL בעלי הקליפה הירוקה (איור 2). מלבד ההבדלים המשמעותיים בצפיפות גבישי השעווה בין הזנים, השעוות שהיו על גבי שני הזנים בעלי מופע הקליפה הלבן היו בתצורה של טסיות רחבות וגדולות, בעוד אלו המעטות שנצפו על גבי הפירות עם הקליפה הירוקה היו קטנות ועגולות יותר (איור 2). לפיכך, התצפיות המיקרוסקופיות קושרות לראשונה את מופע הקליפה הלבן בפרי המלון ליצירה והצטברות מוגברת של גבישי שעווה על גבי קליפת הפרי. יתר על כן, הממצאים מצביעים כי ההבדלים בין הזנים בעלי מופע קליפה לבן לקליפה ירוקה לא נובעים רק מצפיפות שונה של גבישי השעווה על גבי הקליפה, אלא גם מהמבנה והצורה הספציפיים של הגבישים עצמם.

איור 1. זני מלון בעלי מופע קליפה לבן וקליפה ירוקה. (א) פנוטיפ פירות בוגרים משני הזנים VEP ו-NDD1 בעלי מופע קליפה לבן, ומהזנים TVT ו-DUL בעלי קליפה ירוקה. סקאלה = 3 סנטימטר. (ב) הגדלה של פני השטח של הקליפה כפי שנראית תחת בינוקולר. סקאלה = 1 סנטימטר. 

איור 2. צפיפות ומבנה גבישי השעווה על גבי קליפת ארבעת זני המלון. (א) תמונות פני השטח וגבישי השעווה של פירות בוגרים מהזנים VEP ו-NDD1 בעלי מופע קליפה לבן, ומהזנים TVT ו-DUL בעלי קליפה ירוקה, כפי שנצפו תחת מיקרוסקופ אלקטרונים סורק. סקאלה = 1 מילימטר. (ב) הגדלת פני השטח של הקליפה באזורים עם צפיפות גבוהה של שעוות. סקאלה = 10 מיקרומטר. החיצים בתמונות העליונות והתחתונות מצביעים על גבישי השעווה.

אפיון ביוכימי של תכולת והרכב השעוות בקליפת פרי המלון

תוצאות התצפיות המיקרוסקופיות קשרו באופן איכותי בין מופע הקליפה הלבן בפרי המלון לבין הצטברות שעוות על גבי הקליפה. בכדי לבחון כמותית את הקשר הזה ביצענו לראשונה אנליזה מטבולית של פרופיל והרכב השעוות על גבי קליפת פרי המלון בעזרת כרומטוגרפיה גזית משולבת ספקטרוסקופיית מסות. האנליזה הצביעה כי קליפת פרי המלון מהווה מקור עשיר לשעוות, כשסה"כ נמצאו 48 אבני בניין של שעוות מקבוצות ביוכימיות שונות: אלקנים, אלכוהולים, חומצות שומן בעלות שרשראות פחמן ארוכות, טוקופרולים, אלדהידים, אסטרים, טריטרפנואידים ואמידים (איור 3). הקבוצות השכיחות ביותר בהרכב השעווה היו אלקנים ואלכוהולים, כשגם חומצות שומן בעלות שרשראות פחמן ארוכות, טוקופרולים ואלדהידים היוו נתח משמעותי מסך השעוות בקליפת פרי המלון. לאחר קביעת פרופיל הרכב השעווה, השווינו את הרמות של כל קבוצה ביוכימית בקליפות ארבעת הזנים, ומצאנו קורלציות ברורות בין מופע הקליפה הלבן לבין הצטברות מוגברת של אלקנים, אלכוהולים, טוקופרולים, אלדהידים ואסטרים. בניגוד לקבוצות הביוכימיות הללו, חומצות שומן בעלות שרשראות פחמן ארוכות לא הראו מתאם ספציפי עם שני הזנים בעלי מופע קליפה לבן. לדוגמא, קליפת פירות הזנים NDD1 ו-DUL צברו את הרמות הגבוהות ביותר של חומצות שומן שכאלה ו-TVT את הרמות הנמוכות ביותר (איור 3). אי-מתאם נראה גם בקבוצת הטריטרפנואידים כאשר קליפת פירות הזנים VEP, NDD1 ו-TVT צברו רמות זהות בעוד פירות ה-DUL צברו משמעותית רמות נמוכות יותר (איור 3). לבסוף, על אף שמדובר בקבוצה הביוכימית בעלת הנתח הנמוך ביותר מסך השעוות בקליפת פרי המלון, מצאנו מתאם הפוך בין אמידים למופע הקליפה הלבן, כשפירות הזנים TVT ו-DUL בעלי הקליפה הירוקה צברו באופן מובהק יותר אמידים מאשר הזנים VEP ו-NDD1 בעלי מופע הקליפה הלבן (איור 3).

איור 3. אפיון ביוכימי של תכולת והרכב השעוות בקליפת פרי המלון. גרפים המייצגים את רמות אבני הבניין של שעוות שזוהו בקליפת פירות בוגרים מארבעת הזנים הנחקרים לאחר אנליזה ביוכימית ע"י כרומטוגרפיה גזית משולבת ספקטרוסקופיית מסות (GC-MS). אבני הבניין משויכות לקבוצות הביוכימיות: אלקנים, אלכוהולים, חומצות שומן, טוקופרולים, אלדהידים, אסטרים, טריטרפנואידים ואמידים. צירי ה-y מייצגים את שטח הפיק לאחר נרמול לסטנדרט הפנימי אלקן בעל 36 פחמנים. הנקודות על גבי הגרפים מייצגות שלוש חזרות ביולוגיות כשכל חזרה מורכבת משעוות שבודדו מדסקיות קליפה שמקורן לפחות משלושה פירות שונים. מובהקות סטטיסטית חושבה לפי המבחן One-Way ANOVA Tukey’s post-hoc ומוצגת באותיות בעברית מעל העמודות.

סיכום

במחקר הנוכחי הראנו כי קליפת פרי המלון הינה מקור עשיר לשעוות ממגוון קבוצות ביוכימיות. אנו מראים, לראשונה, שבדומה למיני פירות אחרים, מופע הקליפה הלבן במלון קשור להצטברות מוגברת של שעוות על גבי הקליפה, במיוחד של אבני בניין המשתייכות לקבוצות הביוכימיות אלקנים, אלכוהולים, טוקופרולים, אלדהידים ואסטרים. ייצור מוגבר והצטברות של רכיבי שעווה השייכים לקבוצות ביוכימיות אלה, קשורים ככל הנראה לתצורת גבישי שעווה דמויי טסיות רחבות. כאמור, מחקרים קודמים הצביעו על מופע הקליפה הלבן במלון כתכונה דומיננטית שמופתה גנטית לאזור בכרומוזום 7, ולכן יהיה מעניין לבחון את הקשר שבין נתונים גנומיים אלה למאפיינים המטבוליים המתוארים כאן. אנו סבורים כי שילוב הגורמים הללו יובל להבנה מעמיקה יותר של התכונה המובילה למופע הקליפה הלבן, ויציע תובנות חדשות עבור תוכניות טיפוח של זני מלון ששמות להן למטרה לשפר את צבע פני השטח של הפרי כדי לענות על העדפות השוק והצרכן. כמחקר עתידי יהיה נכון לבחון כיצד מופע הקליפה הלבן, כמו גם הצטברות שעוות על גבי קליפת פרי המלון, משפיעים על אספקטים חשובים אחרים כמו חיי המדף של הפרי ויחסי גומלין עם גורמי מחלה.