פיתוח ביו-חיישן לניטור רציף ומוקדם של נוכחות עש התפוח המדומה בבתי אריזה (חלק שני)

Development of a biosensor for real-time and continuous monitoring of the False Codling Moth presence in mandarins

שותפים למחקר:
ד"ר עדי שדה, חוקרת הגנת הצומח, המכון להדברה ביולוגית, מועצת הצמחים
ד"ר יבגני ילצוב, המחלקה לחקר תוצרת חקלאית ומזון, מכון וולקני
שחם מגידיש, שה"מ, משרד החקלאות
בית אריזה הדרי ניצנים

תקציר

במחקר זה פותח ביוסנסור לניטור וזיהוי מוקדם של נגיעות זחלי עש התפוח המדומה ‏(Thaumatotibia leucotreta, FCM) במנדרינות. המערכת נשענת על זיהוי תרכובות אורגניות נדיפות ‏(VOCs) המאפיינות פרי נגוע, ומשלבת חיידקים ביולומינסנטיים מהונדסים הממירים חשיפה לנדיפים לאות אופטי מדיד. הצורך בכלי כזה נובע מדרישת נגיעות אפסית בשווקי היצוא וממגבלות השיטות הנהוגות כיום, המבוססות על בדיקות ידניות או מעבדתיות שאינן רציפות ולעיתים חסרות רגישות בשלבים מוקדמים. לצורך עבודה בטוחה בסביבת מזון פותחה שיטת קיבוע המשלבת ממברנות קלציום אלג'ינט עם שכבת פוליסולפון. השילוב מאפשר דיפוזיה של נדיפים לעבר החיידקים, שומר על יציבות הסיגנל ומונע זליגת תאים לסביבה. במקביל הוגדרו מרקרים המבוססים על חתימה פלואורסצנטית של קליפת המנדרינה לאחר חדירת זחל, אשר מאפשרים אימות מהיר ותמיכה תפעולית בשלבי המיון. התוצאות מצביעות על יכולת הבחנה בין פרי נגוע לבין פרי תקין ועל התאמה ליישום תעשייתי בניטור רציף ובזמן אמת בקווי מיון ואריזה. המערכת מציעה מסלול ישים לשילוב חישה ביולוגית וכימית לשם הקטנת סיכון ליצוא ושיפור הדיוק והמהירות בתהליכי הבקרה.

מבוא

עש התפוח המדומה False Codling Moth (FCM) (Thaumatotibia leucotreta) הוגדר כמזיק הסגר מסוכן בשל היותו פוליפאגי ועלול לפגוע במגוון רב של פונדקאים בעולם. העש תוקף בין היתר הדרים, רימונים, אבוקדו  ועוד [1].  בשל כך נוכחות העש מהווה איום חמור על יצוא פירות לשווקים בחו"ל והדרישה לנגיעות הינה אפס. גילויו של פרי נגוע, ולו בזחל אחד, במהלך בדיקה המבוצעת בהגיע הפרי לנמל היעד פוסל את המשלוח באופן מידי, כאשר מדובר באיחוד האירופי ועלול לחסום לאלתר את היצוא של אותה חלקה למשך שנה למדינות הרגישות לנושא, דוגמת ארה"ב, סין וקוריאה [2]. זחלי העש מתפתחים בפרי ועל פי רוב אין סימני היכר או סימנים משניים בולטים לעין ועל כן קשה לזהות פרי נגוע בפרדס ובבית האריזה [1]. נכון להיום, אגף הביקורת של השירותים להגנת הצומח ולביקורת ושה"מ מפקחים על המצאות נגעים בפרדס ובבית האריזה. בשל ההחמרות בדרישות הייבוא לאיחוד האירופאי, יושמה גישה מערכתית לאזור נגוע בעת"מ הכולל ניטור המזיק בפרדס, פיקוח על תהליך המיון, האריזה וייצוא ההדרים בפרט לייצוא האירופי. לשם הבטחת המשך ייצוא התוצרת, יש לעמוד בדרישות הנהלים של האגף לביקורת. לשם אישור לייצוא מתבצע תהליך ארוך ומסורבל הדורש התייעלות של זמן ושל דיוק: בדיקת המשטחים לאחר האריזה גורמת לעבודה כפולה בשל הצורך בפירוק ואריזה מחדש של מספר משטחים. רמת הדיוק בזיהוי המזיק בשלביו השונים לא תמיד מספקת ולכן נוהגים לשלוח את המזיק לזיהוי בשירותים להגנת הצומח במכון וולקני דבר שמעכב את התהליך באופן משמעותי. לשם כך, יש צורך בפיתוח שיטה פשוטה, טובה ויעילה לניטור רציף ובזמן אמת של נוכחות עש התפוח המדומה בבית האריזה וללא תלות בממד האנושי.

ביוסנסורים הם אחד מכלי הניטור הקיימים המבוססים על תגובות ספציפיות של מרכיב ביולוגי (DNA/RNA, נוגדנים, אנזימים או תאים) או ניטור פיזיקלי (על ידי שיטות אופטיות, תרמיות, אלקטרוכימיות וכדומה) המומרים לערכים מדידים. בעשרים השנים האחרונות פותחו ביוסנסורים לתחומים רבים (בריאות, סביבה, חקלאות, מזון ועוד). פיתוח כלים חדשים בתחום ההנדסה הגנטית אפשרו יצירת ביוסנסורים מבוססים על מיקרואורגניזמים ככלי לניטור זיהומים שונים במים [3]. ביוסנסורים אלו לא רק מאפשרים זיהוי וניטור מהיר (1-2 שעות) של חומרים מסוכנים, אלא גם נותנים מדד על אופן פגיעתם בתאים (כגון: פגיעות בחומר תורשתי, בחלבונים, בממברנות, נזקים מחומרים מחמצנים וכדומה) [4]. מודיפיקציית מיקרואורגניזמים אפשרו יצירת סיגנל מדיד (כגון: שינוי צבע, הארה או זרם חשמלי) כתגובת חשיפה לחומרים רעילים. תאים אלו יכולים לשמש גם כסנסורים לנוכחות מזהמים באוויר במקומות סגורים [5, 6]. בתהליכי פיתוח של ביוסנסורים מבוססי תאים, קיבוע החיידקים קובע רגישות, יציבות ובטיחות.
קיימות שיטות כגון מטריצות הידרוג'ל (אלג'ינט, אגרוז), ספיחה או קישור קוולנטי, שלכל אחת חדירות שונה ל  VOCs, סכנת זליגה ועלויות אחרות. קלציום-אלג'ינט עדין לתאים, חדיר לנדיפים וזמין לעיבוד, ובשילוב שכבת פוליסולפון הוא מצמצם זליגת תאים ומשפר עמידות מכנית. בחירה אופטימלית של שיטת הקיבוע חיונית לעבודה בסביבת מזון ולניטור רציף בקנה מידה תעשייתי.

ניטור חומרים נדיפים באוויר: בנוסף לכ-1000 סוגים שונים של חומרים אורגנים נדיפים נפלטים מצמחים [7] כל סוג חרק פולט חומרים נדיפים יעודים משלו (פרומונים וכו'). לכן יש פוטנציאל רב לשיטות המאפשרות זיהוי רציף של חומרים אלו באוויר במקומות אחסון או אריזה, לגילוי מוקדם של מזיקים בהם. בשנים הקודמות נעשה שימוש בשיטות של בידוד חומרים (headspace solid phase microextraction (HS-SPME)) ושילובם עם גז כרומטוגרפיה (chromatography–mass spectrometry (GC–MS)) לגילוי נוכחות חרקים. במקרים אלו נאספות דוגמאות של אוויר כאשר זיהוי המזיק מתבצע על ידי זיהוי של פרומונים ומטבוליטים [8] או חומרים אורגנים נדיפים המשמשים לקומוניקציה בין אותו מין של חרקים [9]. שיטות אלו מורכבות, הדורשות ציוד יקר ולא ניתן לנטר בזמן אמת. על כן בלתי ניתן ליישום בתנאי שדה.

מרקרים כימיים לניטור מזון: בנוסף לשיטות מעבדה וחיישנים ביולוגים, קיימים מרקרים צבעוניים ופלואורסצנטיים שמספקים תגובה מיידית, עלות נמוכה ושילוב פשוט בקווי מיון. הם יכולים להיות שימושים לזיהוי נגיעות, לקיצור זמני בדיקה ולשיפור הבקרה לאורך שרשרת האספקה. שינוי התכונות הכימיות של הקליפה כתוצאה מחדירת זחלים ,יכולים לשמש כמדד עקיף ואמין לנוכחות הזחל. למשל סקופולטין המשתחרר בעת חדירה ביוטית לקליפת המנדרינה יכול לשמש מרקר, משום שפלואורסצנציה אופיינית תחת UV או שינוי צבע במגע עם בסיס חלש מסמנים את אזור החדירה ומאפשרים מיון מהיר.

בגיליון האחרון של "עת הדר" (יולי 2025) פרסמנו את סקירת הנדיפים היחודיים למזיק העת"מ במנדרינות אור. חשיבותם גדולה על מנת שנוכל לבחור ולהנדס חיידקים הרגישים לתרכובות ספציפיות אלה וכמובן שיגיבו ביעילות ובמהירות לנוכחות פרי נגוע.

בגיליון זה, בשלב שני של המחקר–פותחו מרקרים לזיהוי העש באמצעות טביעת אצבע פלואורנסטית ובשלב שלישי מוצג פיתוח הביוסנסור האחראי על כל שלבי הניטור ויצירת הסיגנל המודיע על נוכחות פרי חשוד.

פיתוח מרקרים לזיהוי נוכחות עש התפוח המדומה במנדרינות

זיהוי טביעת אצבע פלואורסצנטית של פירות עם וללא מזיק

בשלב זה בחנו את הפעילות הפלואורסצנטית (הארה) באזורי החדירה של הזחלים לתוך הפרי והשוונו לעומת פרי נקי ללא זחל.

פעילות פלורסנטית נמצאה מקושרת לחומר סקופרון- נוצר כתוצאה מתגובות כימיות של כיטין הנמצא על פני חרקים עם מולקולות שמשתחררות כאשר קליפת פרי הדר נפגעת בזמן חדירה.

ניתן לראות באיור 1 שני אורכי גל בתחום של 300-700 ננומטר, זוהו שני אורכי גל, 365 ו-575 ננומטר, שבהם נצפה ההבדל המקסימלי בין הדגימות החיוביות (קו רציף) לשליליות (קו מקווקוו).

בנוסף, בחנו את ההשפעה של פגיעה מכאנית לפגיעה ביולוגית.

לשם כך בחרנו באורך גל של 365 ננומטר כגל המייצג לניסוי. לשם כך, נבדקו למעלה מ-100 דגימות של פירות נגועים ולא נגועים. במהלך הניסוי הוסרו קליפות מאזורים נגועים ותקינים ונבדקו באמצעות מכשיר קורא פלטות. איור 2 מציג את השוני בעוצמת ההארה שנמדדה על פני שטח הקליפה בפירות לא נגועים, נגועים ופצועים באופן מלאכותי. נצפה שוני מובהק בין דגימות הפירות הנגועים לאלו שאינם נגועים, כאשר הדגימות הנגועות הציגו עוצמות הארה גבוהות יותר בהשוואה לפירות שאינם נגועים. באופן מעניין, העוצמה הנמוכה ביותר של ההארה נצפתה בקליפות שנפצעו באופן מלאכותי. הסיבה לכך יכולה להיות קשורה לתהליך הפציעה עצמו, שבו הפגיעה הפיזיקלית אינה משפיעה על הפרופיל הביוכימי של הפרי באותה מידה כמו זיהום ביולוגי פעיל. פציעה מלאכותית אינה מביאה לשחרור חומרים ביוכימיים פעילים או לשינויים ברמת הפעילות המטבולית שיכולים להוביל להגברת הפלואורסנציה. בנוסף, פציעה מלאכותית עלולה לגרום לתגובת דיכוי מקומית של התהליכים הביוכימיים בקליפה, מה שמסביר את העוצמה הנמוכה יותר של ההארה באזורים אלו. תוצאות אלו מצביעות על הפוטנציאל של שימוש בפעילות פלואורסנטית ככלי לזיהוי והבחנה בין פירות נגועים בזחלים לבין פציעות פיזיקליות, תוך הדגשת החשיבות של בחירת מרקרים ספציפיים ורגישים לפעילות ביולוגית פתוגנית.

ניטור חומרים אופציונלים שישמשו בהמשך כמרקרים לזיהוי סקופרון

השלב הבא במחקר התמקד בביצוע סקר ספרות נרחב לזיהוי חומרים כימיים פוטנציאליים שיכולים לשמש כמרקרים לזיהוי סלקטיבי של סקופולטין או סקופארון (ממשפחת הקומרינים) באוויר כגון ברזל כלורי ,(FeCl₃) חומצה בורית ,(H₃BO₃) ובסיסים חזקים כמו NaOH. חומרים אלה ניתנים למדידה באמצעות ספקטרומטריה או במערכת ויזואלית, למשל בעת שינוי צבע, פלואורסנציה או חמצון. מטרת שלב זה הינו מציאת אפשרויות חדשות, בטוחות ויעילות, שיאפשרו ניטור מהיר ולא פולשני של פירות נגועים באמצעות תגובות כימיות עם האוויר הסובב אותם לבחינת נוכחות זחלי עת"מ במנדרינות.

בדיקת יכולת של מרקר לזהות נוכחות זחלים במנדרינות

לשם בחינת המרקרים נבחר חומר זמין במעבדה – סודיום הידרוקסיד ,(NaOH)  שהועבר על פני השטח של קליפת מנדרינות עם וללא זחלים. הבדיקה בוצעה באזורים סביב נקודות חדירה של זחלים לתוך הפרי ואכן נמצאה עוצמת הארה גבוהה יותר באופן מובהק עבור הפירות הנגועים לעומת קליפה מפירות נקיים. בנוסף נמצאו הבדלים ויזואליים רבים על פני שטח הקליפה של מנדרינות שנחשפו לסודיום הידרוקסיד כאשר דגימות מפרי נגוע מראות שינויי צבע בולטים לעומת דגימות מפרי לא נגוע (תמונה 1).

פיתוח ביוסנסור לניטור רציף ובזמן אמת לנוכחות עש התפוח המדומה במנדרינות

המערכת שפותחה ומוצגת כאן מורכבת מרכיבים ביולוגים ומרכיבים מכאניים ואלקטרונים.

(א) המערכת בנויה מחלק ביולוגי (חיידקים מאירים כתלות בנוכחות חומרים באוויר) וחלקים מכאניים שמזהים את הארה ומעבירים למחשב או נייד. ביוסנסורים מפוזרים במקום האחסון. (ב) מייצרים רשת שדוגמת אוויר בצורה רציפה. בנוכחות מזיק (ג+ד) החיידקים מייצרים סיגנל מדיד שמעובר מסנסור למחשב (ה) או טלפון נייד (ו).

אופטימיזציה לתהליכי קיבוע

פותחה מערכת חדשנית שבה זרימה מבוקרת של תמיסת קלציום כלוריד ותערובת של חיידקים ואלג'ינט מתמזגות ליצירת ממברנה אחידה בתהליך פלמור רציף. התהליך כולל מגע מתמשך בין הזרמים בצינורות, עד להשלמת הפלמור במיכל אינקובציה המכיל קלציום כלוריד, שממנו נחתך גליל הממברנה לטבליות מוכנות לשימוש, שיטה זו מאפשרת יצירת ממברנות אחידות מבחינת הרכב, צפיפות וגודל, תוך שמירה על תהליך ייצור מדויק ויעיל.

פיתוח שיטת הקיבוע החדשה לממברנות קלציום-אלג'ינט מהווה שדרוג משמעותי בתהליכי עבודה מדעיים וטכנולוגיים המשלבים חיידקים כביוריפורטר. האחידות שמתקבלת בממברנות מבטיחה הפחתת התלות במיומנות טכנית ידנית, ומאפשרת ייצור ממברנות בכמויות גדולות באופן מהיר ומדויק.

מבנה זה מבטיח אינטראקציה יעילה בין החומרים הנדיפים לבין החיידקים, תוך שמירה על הבטיחות ועל יציבות המערכת לאורך זמן. הממברנה המשולבת מספקת פתרון כפול: שמירה על החיידקים המקובעים בתוך הממברנה וקליטת מידע מדויק על שינויים בהרכב החומרים הנדיפים באוויר.

תוצאות הניסוי הראו הבדל משמעותי בין הממברנות: ממברנות ללא פוליסולפון (Polysulfone –) הראו עלייה ניכרת בפעילות הלומיניסנטית, בעיקר לאחר 4 שעות חשיפה, מה שמעיד על זליגת חיידקים משמעותית לסביבה. לעומת זאת, בממברנות עם פוליסולפון (Polysulfone +) נצפתה פעילות לומיניסנטית נמוכה לאורך כל הניסוי, המצביעה על מניעת זליגת חיידקים בזכות שכבת הפוליסולפון. תוצאות אלו חשובות במיוחד כאשר מדובר בשימוש בחיידקים מהונדסים גנטית בסביבות של פריטי מאכל, כמו מנדרינות. חיידקים מהונדסים משמשים ככלי מדידה רגיש במערכות ביוריפורטרים, אך זליגתם אל הסביבה המימית או אל פרי המיועד לצריכה מהווה חשש בטיחותי משמעותי. שכבת הפוליסולפון, ממזערת את הסיכון.

בינה מלאכותית ככלי מתקדם לניטור זחלים

אוסף הנתונים הרב רוכז במאגר נתונים מרכזי ועובד באמצעות שיטות מתקדמות של בינה מלאכותית. עיבוד זה מאפשר זיהוי תבניות מורכבות מתוך מאגר נתונים רחב ("ביג דאטה") והפקת מדדים מדויקים המייצגים את ההבדלים בין דגימות נגועות ולא נגועות באופן הוליסטי ומבוסס. בזכות הכלים המתקדמים של בינה מלאכותית, התאפשר לנו לעבד את כל הנתונים יחדיו למדד כמותי משולב אחד לכל נקודת זמן. שינוי זה מאפשר מעבר מניתוח של עשרה מדדים נפרדים עבור כל יום מדידה, לשני מדדים מרכזיים בלבד – אחד עבור מנדרינות נגועות ואחד עבור לא נגועות. תהליך זה משפר את היכולת לנתח את התוצאות בצורה יעילה ומדויקת, ומאפשר שימוש מעשי במסקנות המחקר במערכות ניטור עתידיות.

מקורות

[1] משרד החקלאות ופיתוח הכפר שירות ההדרכה והמקצוע תחום הגנת הצומח פברואר 2016. פרוטוקול לניטור ולהדברה של עש התפוח המדומה. ד"ר שאול בן יהודה וחבוריו  משרד החקלאות ופיתוח הכפר, בית דגן.

https://www.moag.gov.il/shaham/ProfessionalInformation/Pages/protokol_false_codling_moth_2016.aspx

[2] משרד החקלאות ופיתוח הכפר שירות ההדרכה והמקצוע אוגוסט 2017. עש התפוח המדומה בהדרים- התמודדות, מניעה והדברה. לאה סלע וחובריה

https://www.moag.gov.il/shaham/ProfessionalInformation/Pages/false_codling_moth_august_2017.aspx

[3] E. Eltzov, R.S. Marks, Fiber-optic based cell sensors,  Whole Cell Sensing Systems I, Springer2009, pp. 131-54.

[4] E. Eltzov, R.S. Marks, Whole-cell aquatic biosensors, Analytical and Bioanalytical Chemistry, 400 (2011) 895-913.

[5]   E. Eltzov, A. Cohen, R.S. Marks, Bioluminescent liquid light guide pad biosensor for indoor air toxicity monitoring, Analytical Chemistry, 87 (2015) 3655-61.

[6]   E. Eltzov, V. Pavluchkov, M. Burstin, R.S. Marks, Creation of a fiber optic based biosensor for air toxicity monitoring, Sensors and Actuators B-Chemical, 155 (2011) 859-67.

  [7] E. Pichersky, J.P. Noel, N. Dudareva, Biosynthesis of Plant Volatiles: Nature’s Diversity and Ingenuity, Science (New York, NY), 311 (2006) 808-11.

[8] L. Arnaud, et al., Is Dimethyldecanal a Common Aggregation Pheromone of Tribolium Flour Beetles?, Journal of Chemical Ecology, 28 (2002) 523-32.

[9] M.L. Villaverde, M.P. Juárez, S. Mijailovsky, Detection of Tribolium castaneum (Herbst) volatile defensive secretions by solid phase microextraction–capillary gas chromatography (SPME-CGC), Journal of Stored Products Research, 43 (2007) 540-5.